第一部分帕金森相关蛋白α-synuclein新的降解机制的探讨目的:α-突触核蛋白(α-synuclein)是帕金森病(PD)一种重要的致病蛋白,其异常聚集的出现是帕金森病的主要病理特征。因此,及时有效地清除α-synucelin可能是治疗帕金森病的一个潜在方法。本研究目的在于观察线粒体自噬对α-synucelin蛋白降解的作用。方法:体外培养SH-SY5Y和He La细胞系,在细胞中建立EGFP-α-synuclein和其突变体EGFP-α-synuclein-A53T过表达模型。采用线粒体分离提取法检测α-synuclein和α-synuclein-A53T在线粒体上的富集情况。加入线粒体解偶联剂carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone(CCCP)、自噬诱导剂雷帕霉素(rapamycin)、自噬溶酶体抑制剂Bafilomycin A1等药物处理细胞,运用荧光显微镜观察α-synuclein和α-synuclein-A53T荧光表达的强弱,western blot检测α-synuclein、α-synuclein-A53T、TOMM20、COXIV等蛋白量的改变。此外在He La细胞中分别共转染Flag和EGFP-α-synuclein或EGFP-α-synuclein-A53T;Flag-Parkin和EGFP-α-synuclein或EGFP-α-synuclein-A53T,加入CCCP处理,用荧光显微镜检测α-synuclein和α-synuclein-A53T荧光表达的强弱和western blot检测α-synuclein和α-synuclein-A53T蛋白水平的变化。利用α-synuclein-A53T转基因鼠模型,喂食含有CCCP处理过的食物,8个月后通过western blot检测中脑组织α-synuclein的蛋白水平的改变。结果:线粒体分离实验表明α-synuclein和α-synuclein-A53T在线粒体上有富集。SH-SY5Y细胞过表达α-synuclein和α-synuclein-A53T后,加入CCCP诱导线粒体自噬发生,发现α-synuclein和α-synuclein-A53T的荧光强度与对照组相比明显减弱,western blot检测发现α-synuclein和α-synuclein-A53T的蛋白水平也明显降低。而加入rapamycin(一种自噬诱导剂)并没有引起α-synuclein和α-synuclein-A53T荧光强度和蛋白量的改变。进一步研究发现,CCCP+Bafilomycin A1处理时,CCCP引起的α-synuclein-A53T蛋白量的减少能够被Bafilomycin A1有效抑制。在Parkin缺陷的Hela细胞系中,加入CCCP和rapamycin处理后,不引起α-synuclein和α-synuclein-A53T量的变化。然而,在Hela细胞中过表达Parkin后,CCCP可引起α-synuclein和α-synuclein-A53T蛋白量的降低。荧光观察结果也显示α-synuclein和α-synuclein-A53T的荧光强度与对照组比明显减弱。动物实验结果显示,CCCP药物喂食的α-synuclein-A53T转基因鼠与对照组相比,其α-synuclein在中脑表达量有明显降低。结论α-synuclein和α-synuclein-A53T可通过线粒体自噬降解。这可能成为α-synuclein一条新的降解通路。第二部Parkin通过调控p62抑制6-OHDA引起的细胞死亡目的:Parkin蛋白编码基因(PARK2)突变或缺失引起的Parkin蛋白功能障碍与帕金森病发生直接相关。本研究探讨Parkin对神经元保护效应的分子机制。方法:采用免疫共沉淀法分析Parkin与p62的结合与泛素化情况。碘化丙啶(PI)和Hoechst双染色法检测细胞死亡情况。在过表达p62或者过表达Parkin的SH-SY5Y细胞系中加入6-OHDA处理,用western blot检测ERK1/2的活化情况。He La细胞中过表达Parkin或者沉默p62后再过表达Parkin,用western blot检测磷酸化ERK1/2和p62的蛋白水平的变化。结果:免疫沉淀实验发现p62和Parkin有相互作用,并且Parkin能够通过其E3泛素连接酶活性泛素化p62。Western blot结果显示,过表达Parkin能够增加p62的蛋白量,同时抑制ERK1/2的活化。但是当沉默掉p62后,Parkin不能再抑制ERK1/2的活化,提示Parkin对ERK1/2的作用依赖于p62。在6-OHDA处理细胞中,Parkin和p62都能降低6-OHDA引起的磷酸化ERK1/2水平的提高。PI染色结果显示过表达Parkin能够抑制6-OHDA引起的多巴胺能(DA)神经元的死亡。结论:Parkin通过泛素化稳定p62的蛋白量来降低6-OHDA引起的ERK1/2活化,从而起到对神经元的保护作用。