随着生命科学研究的发展和深入，细胞分化、去分化和再分化逐渐成为生命科学领域研究的热点。研究表明，在基因水平利用基因导入或细胞工程技术，可以纠正遗传物质缺陷及基因表达异常，使失控的癌细胞向正常方向转化。此外，蛋白质组学技术的发展为肿瘤发生、发展机制的研究提供了新思路。因此在基因和蛋白质水平研究细胞分化、去分化和再分化的机制可为肿瘤的发生及治疗提供重要依据。正常情况下，哺乳类红细胞终末分化是由骨髓造血干细胞依次历经红系定向祖细胞、原幼红细胞、早幼红细胞、中幼红细胞、晚幼红细胞和网织红细胞等不同的发育分化阶段，其终末分化的主要特征是分化的红系细胞停止分裂并开始表达血红蛋白，细胞体积逐渐缩小、细胞核固缩、偏位、自然排核等，形成网织红细胞，通过血脑屏障进入到外周血中发育为成熟红细胞。在正常分化过程中如果受到物理、化学、环境等因素的影响，红系细胞则停止分化，异常增殖，细胞停滞在分化阶段，珠蛋白等终末分化相关基因关闭，细胞发生癌变。这些明显的分化特征是红系细胞特有的，而其它类型细胞所不具备的。据报道，已有多种细胞分化诱导剂如：氯高铁血红素（hemin）、二甲基亚砜（Dimethysulfoxide，DMSO）、丁酸钠（Sodium butyrate，NaBu）、六甲基烯二乙酰胺（Hexamethylene bisacetamide，HMBA）和全反式维甲酸（ATRA）等，这些诱导剂可在体外诱导红白血病细胞，使细胞发生重编程，重新进入红系分化阶段，细胞增殖速度减慢，珠蛋白基因开启并表达血红蛋白。此外，胞质杂交体模型是研究胞质因子对细胞调控的很好模型，该模型是利用正常分化的无细胞核的网织红细胞与异常分化的骨髓瘤细胞进行细胞融合，经筛选即可获得胞质杂交体（cybride）。由于胞质杂交体中的网织红细胞的胞质因子可以调控肿瘤细胞的生长，使肿瘤细胞恶性逆转。迄今，研究与红系分化相关的特异性调节因子主要集中在红系分化早期阶段，而时序性进入红系终末分化，尤其是与正常红系细胞排核相关的调控因子尚无确切报道，而白血病细胞的核增殖和分裂是失控的。深入、系统地研究并阐明细胞的分化与去分化（癌变）的机制，是生命科学领域研究的热点和难点。本论文选用诱导剂Hemin诱导K562细胞向红系分化和小鼠网织红细胞与人K562细胞融合得到的胞质杂交体这两个实验模型作为研究对象，利用蛋白质组学方法结合质谱技术高通量地筛选哺乳类红系终末分化过程中差异表达的蛋白质，从中筛选与分化、去分化相关的因子，蛋白质复合体乃至构建网络调控系统。这些调控因子的鉴定对于阐明红系细胞终末分化的机制及开发治疗红白血病的靶向特异性药物具有重要的理论意义和临床应用价值。Hemin诱导K562细胞向红系分化系统：利用Hemin作为分化诱导剂诱导K562细胞向红系分化，用联苯胺染色检测红系分化的指标，即血红蛋白的表达；用细胞计数法和MTT比色法分别检测hemin对K562细胞增殖和细胞活力的影响；用流式细胞术和免疫细胞化学等方法对hemin诱导K562细胞分化前后细胞周期分布、红系分化表面标志等进行时序性观测。同时利用双向电泳偶联质谱技术，结合生物信息学分析了hemin诱导的K562细胞在红系分化过程中差异表达的蛋白质，经分析鉴定从中筛选差异蛋白并对其功能进行初步研究。胞质杂交体系统：用盐酸苯肼诱发小鼠网织红细胞，利用细胞融合技术，将小鼠网织红细胞与K562细胞进行细胞融合，构建了胞质杂交体。并通过抗性筛选获得稳定细胞株。在基因水平上对其分别在细胞分化、增殖、凋亡、癌基因等方面进行鉴定；用MTT比色法检测了胞质杂交体的细胞活力，利用双向电泳偶联质谱技术及生物信息学分析了网织红细胞胞质因子在对K562细胞调控过程中差异表达的蛋白质，并从筛选重要的蛋白质进行功能研究。hemin诱导K562细胞分化结果表明：K562细胞经hemin诱导24h时，K562细胞已经表达血红蛋白，联苯胺染色呈阳性，说明K562细胞已经开始向红系分化，随着诱导时间的延长诱导率逐渐升高，且每个时间点随着诱导剂浓度的升高，诱导效率逐渐升高，96h时，40μM的hemin诱导效率达到72%；细胞生长曲线和MTT检测细胞活力的实验结果表明：hemin对K562细胞的增殖和细胞活力有一定的影响，但在一定时间范围内不同浓度的hemin对K562细胞的细胞活力影响不明显；流式细胞仪检测细胞细胞周期结果表明：hemin并未影响K562细胞的细胞周期分布；免疫细胞化学检测了红系分化的表面标志TER119和GPA的表达变化，结果发现两种蛋白在细胞分化过程中都有表达且主要定位在细胞膜和细胞质中；双向电泳分离了hemin诱导K562细胞分化前后表达的差异蛋白，经质谱鉴定有66个蛋白差异表达，经生物信息学分析对这些蛋白按功能进行了分类并做了初步总结，主要包括以下几类：血红蛋白及其合成相关的蛋白、mRNA转录和加工及蛋白质翻译修饰相关的蛋白、氧化还原代谢相关的蛋白、细胞迁移及细胞骨架系统相关蛋白、各种代谢相关的酶类、细胞应激反应相关蛋白及一些功能未知的蛋白。胞质杂交体的实验结果表明：小鼠网织红细胞与K562细胞经细胞融合和筛选获得了稳定的细胞株MR.K562；其增殖相关基因c-myc表达下调，红系分化特异性基因gata-1表达上调；MTT实验检测稳定株的细胞活力，结果表明与正常K562细胞相比MR.K562细胞增殖速度减慢，对hemin的敏感性增强；通过双向电泳和质谱鉴定，该模型鉴定出64个差异蛋白，并对这些蛋白依功能进行了分类和初步总结，功能分类主要包括：能量代谢相关蛋白、信号通路相关蛋白、蛋白质合成、转录调控、运输、细胞周期、细胞凋亡、细胞迁移及细胞骨架系统相关、细胞增殖相关蛋白及一些功能未知的蛋白。另一重要发现是核仁磷酸蛋白（Nucleophosmin, NPM1）在这两个系统中均有差异表达，据报道NPM1是个多功能蛋白，其在核糖体合成、中心体复制、组蛋白分子伴侣、胚胎发育、肿瘤发生等多方面都发挥重要功能，但其在哺乳动物红系分化中功能尚未明确。此外，本实验前期研究也发现NPM1在丁酸钠（SB）诱导MEL细胞向红系分化中表达下调、胎肝造血系统中亦差异表达，故选择核仁磷酸蛋白NPM1对其在哺乳动物红系分化中进行初步功能研究。（1）应用Western blot验证了NPM1在诱导分化和胞质杂交体中均差异表达。（2）应用RNA干扰技术和过表达技术分别构建pLKO.1-NPM1干扰载体和pLJM-NPM1过表达载体，用慢病毒包装技术侵染K562细胞并筛选获得了NPM1低表达的K562-NPM1-shRNA稳定株和NPM1过表达的K562-pLJM-NPM1稳定株。（3）通过MTT实验和Hemin诱导分化实验，检测NPM1低表达和过表达分别对K562细胞的活力和分化能力的影响。（4）运用串联亲和纯化（TAP）结合质谱技术分离鉴定与NPM1相互作用的蛋白质复合体，此部分实验正在进行中。为进一步探讨NPM1在红系分化过程中的功能及作用机制奠定理论和实验基础。综上所述，本论文选取了两个研究红系分化的模型，其优势在于，hemin诱导K562细胞向红细分化是利用化学诱导剂直接作用于有核的K562细胞，重新开启其珠蛋白基因，诱导其重编程进入正常分化途径，为研究细胞分化、去分化和再分化提供了理论依据；而胞质杂交体是利用无核的网织红细胞的胞质因子调控有核的K562细胞。最重要的是在这两个系统及本课题组前期研究中都发现了核仁磷酸蛋白NPM1差异性表达，说明NPM1可能在哺乳类红系分化中发挥重要功能。本论文对其功能进行了初步研究，为探讨其在红系分化中的具体功能，有关NPM1的功能研究还有待深入。