由于气候变化、环境污染等不良环境因素导致的逆境胁迫包括紫外线辐射、干旱、淹水、高低温、盐碱、重金属、病害和虫害等,都给油菜的生产带来了严重的负面影响。随着油菜全基因组测序的完成,油菜基因的功能挖掘对于油菜抗逆功能的研究具有重要的理论和实际意义。我们在前期研究的基础上,发掘到一个与油菜叶片表皮毛发育相关的基因,继而与植物抗逆可能具有密切联系的nsLTP家族基因,拟通过对该基因在这些过程中的功能及作用机制进行剖析,初步揭示该基因抗逆的功能。早已证实植物表皮毛作为植物表面抵抗外界不良环境的天然屏障,同时表皮毛是次级代谢产物生物合成与分泌的“生化工厂”,同植物抵抗逆境密切相关。众多研究表明,nsLTP家族基因确实可能在植物表皮毛生长发育和表皮毛次级代谢方面从而在逆境胁迫过程中起到重要作用。本研究的目的是为了探明该基因具体参与表皮毛生长发育的哪个环节,具体影响表皮毛中哪些种类的次级代谢物,以及在哪些逆境胁迫方面具有一定的抗逆性。为了开展相关研究,本课题开展了以下研究工作:1、BraLTP2基因基本功能特征分析通过生物信息学方法对BraLTP2基因及同源基因进行保守结构域预测、保守位点分析、信号肽预测和启动子调控元件分析。结果显示,BraLTP2基因与油菜中的BnaLTP1具有99%的同源性,与拟南芥中的AtLTP1具有76%的同源性。蛋白特征分析显示,其具有该家族蛋白所共有的保守结构,8个半胱氨酸残基并形成4个二硫键。进一步的研究是通过构建启动子分析载体,利用农杆菌介导的遗传转化体系,获得转基因材料,分析BraLTP2基因的时空表达规律。我们重点关注在叶片及其表皮毛部位的表达,组织化学染色结果显示,BraLTP2基因在叶片表皮毛部位具有时空表达特异性。另外,通过构建BraLTP2::GFP融合表达载体,分析BraLTP2蛋白的亚细胞定位。镜检观察结果显示,该蛋白定位在表皮细胞胞外和表皮毛边缘位置。2、BraLTP2基因在表皮毛生长发育方面的研究为了揭示BraLTP2基因在表皮毛生长发育过程中的功能特点,我们通过构建BraLTP2超量表达载体,通过农杆菌介导的遗传转化方法获得BraLTP2超表达转基因油菜植株,并进行分子生物学鉴定。通过对其中6个株系的转基因油菜进行相对表达量的测定,我们选取35S::BraLTP2-3和35S::BraLTP2-4两个株系进行表型鉴定。通过显微镜和扫描电镜观察,确定超表达BraLTP2基因后,转基因油菜叶片表皮毛密度发生了显著的增加,相同叶面积的转基因油菜叶表皮毛数量增加20倍以上。但是在株高,植株形态以及表皮毛性状方面同对照组没有差异。因此我们推断,该基因特异性调节表皮毛生长和发育过程,主要集中体现在改变了表皮毛的密度。3、超量表达BraLTP2基因对油菜次级代谢物的影响利用基于LC-MS/MS平台的广泛靶向代谢组学技术,比较BraLTP2超表达转基因油菜和野生型油菜叶片次级代谢物组成与含量的差异。检测结果显示,共发现89种差异代谢物,其中43种含量显著上调的次级代谢物可以分为7大类,包括黄酮类、苯丙素类、酚胺类、生物碱类、萜类、有机酸类和其他次级代谢物类。我们发现与抗逆相关的次级代谢物含量变化差异显著,例如黄酮类、苯丙素类、酚胺类和生物碱类等物质。该部分实验研究揭示了超表达BraLTP2基因影响油菜叶片次级代谢物的组成和含量,推断BraLTP2功能涉及次级代谢物的合成或积累。4、BraLTP2基因在抗逆功能方面的研究初探结合BraLTP2基因的基本功能特征及其在油菜表皮毛生长发育、代谢水平方面的研究结果,推断该基因可能具有一定的抗氧化特性。我们测定转基因和野生型植株在不同浓度的MV溶液胁迫处理下种子萌发率、幼苗生长过程中株高和根长等性状的差异。结果显示,在强氧化剂的胁迫处理下,相对于野生型而言,BraLTP2超表达转基因油菜种子萌发率受到轻微的影响,但是测定结果并未达到统计学上显著性的水平。幼苗的株高和根长,也未达到统计学上的显著性水平。我们进一步在MV胁迫下测定五大类抗氧化酶CAT、APX、GR、POD和SOD的活性。结果显示,在35S::BraLTP2转基因植物叶片中,CAT、APX、POD和SOD等主要抗氧化酶的活性均有显著提高,进一步证明了该基因的抗氧化功能。