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孜然是重要的香料植物,孜然精油是孜然种子的水蒸气蒸馏产物,具有抗氧化、抑菌和驱虫等多种功能。本文以“敦玉1号”孜然种子为原料,通过改良优化精油提取工艺以期提高精油得率,并对优化工艺对孜然精油组成成分、抗氧化和抗菌活性的影响进行了分析;重点比较了孜然精油与其主要成分枯茗醛对粉红单端孢(Trichothecium.roseum)的抑菌活性;研究了孜然精油与枯茗醛抑制T.roseum菌生长的协同性;通过显微观察和关键生化指标的测定联合RNA-seq比较转录组学和i TRAQ定量比较蛋白组学技术探究了孜然精油主要成分枯茗醛的抑菌机理。结果表明:1.酸解和粉碎程度显著影响精油得率。通过PBD设计与BBD优化:将孜然粉碎至40目,在3 mol/l HCl中进行45 min酸解,精油得率为3.802%,比传统工艺(2.562%)精油得率增加48.4%。优化工艺所得精油GC-MS鉴定出53种物质,其中相对含量大于10%的物质依次为枯茗醛(25.14%)、γ-松油醛(12.74%)、γ-松油烯(11.88%)和α-松油烯(11.47%);而传统工艺所得精油鉴定出47种物质,相对含量大于10%的物质依次为枯茗醛(21.89%)、β-蒎烯(20.49%)、γ-松油烯(18.37%)和γ-松油醛(10.98%)。两种精油的最主要组分均为枯茗醛,但优化工艺精油含有更多的酚类和醇类。2.与传统工艺精油相比,优化工艺精油在DPPH自由基清除效果,ABTS自由基清除效果和铁离子还原抗氧化能力和β-胡萝卜素漂白的抗氧化能力更高,分别达到传统工艺精油的2.4,4.1,73.7和3.2倍;优化工艺精油对四种采后病原菌(Alternaria alternata,Penicillium expansum,T.roseum和Fusarium sulphureum)的菌丝生长,孢子萌发均具有更强的抑菌活性,其中对T.roseum的抑制活性最强。优化工艺所得精油对上述四种真菌的最低抑菌浓度(MIC)为传统工艺精油的1/2;其对四种真菌的最低杀菌浓度(MFC)均低于传统工艺精油。3.枯茗醛对T.roseum的抑菌效果显著强于孜然精油,二者具有不同的抑菌动力学模型。二者对T.roseum的抑制作用存在剂量响应关系。在PDA上直接接触给药时,孜然精油的MIC为1μl/ml,而枯茗醛的MIC为0.5μl/ml。挥发态给药时两种抑菌剂的MIC值均为直接接触条件下的1/10;而两种给药方式下,枯茗醛的MIC为孜然精油的1/2。氧化剂硫酸铜能够显著增强其抑菌活性,而抗坏血酸能削弱抑制作用。4.在PDB中,孜然精油对T.roseum的MIC值为15.625μl/ml,MFC值为31.250μl/ml;枯茗醛对T.roseum的MIC值为3.906μl/ml,MFC值为7.812μl/ml。根据时间动力学模型分析,孜然精油在接触720 min后达到高效致死,枯茗醛则在175 min达到,最优浓度组合则在145 min后达到,抑菌能力(k值)表现为最优混合>枯茗醛>孜然精油。棋盘法模型和响应面模型分析表明孜然精油和枯茗醛在在杀死孢子和抑制孢子萌发上具有显著的协同效应。5.枯茗醛处理后T.roseum的致病力明显下降,洗涤后菌体对苹果的侵染能力依然较弱;处理降低了菌体质膜的麦角甾醇含量;处理后菌体的ATPase和线粒体脱氢酶活性均下降。处理后的T.roseum孢子和菌丝均有活性氧的积累,菌体通过自身的SOD和CAT等内在抗氧化体系以应对外在胁迫。处理后的菌体膨大,表面粗糙,质膜变薄,胞内细胞器变形解体,出现典型的衰老特征。6.枯茗醛处理T.roseum后,转录组学研究总共筛选出1516个基因表达上调,1309个基因下调,这些差异上调基因功能涉及蛋白质降解,信号传导系统,酮酸分解和氧化还原过程;而下调表达基因主要涉及菌体细胞分裂,中央代谢和核糖体代谢。蛋白组学分析总共筛选出上调表达蛋白90个,功能主要涉及酮酸和氨基酸分解,小分子代谢等;下调表达蛋白135个,其功能主要涉及生物合成,核糖体功能和翻译等。从代谢通路的角度整合转录组和蛋白组学信息,揭示枯茗醛处理后,菌体的抗生素合成代谢和脂类分解代谢加强,而糖代谢水平下降,细胞出现衰老的代谢特征。综上所述,酸水解结合适度粉碎能够极显著提高孜然籽粒的水蒸馏精油得率,所得孜然精油比传统水蒸馏精油具有更好的抗氧化与抗真菌活性;孜然精油主成分枯茗醛比精油自身具有更强的抗T.roseum能力,而且二者对T.roseum的抑菌作用存在协同性;孜然精油主成分枯茗醛能够显著降低T.roseum的致病力,破坏该菌体的细胞结构和产能体系,并对其造成氧化胁迫;转录与蛋白双重组学分析揭示枯茗醛处理引起T.roseum菌体膜脂降解和抗生素等次生代谢物合成加剧,糖代谢能力降低。