论文部分内容阅读
小鼠上胚层干细胞（mouse epiblast stem cells，EpiSCs）是一种来源于5.5-7.5胚龄(E5.5-7.5)的着床后的胚胎上胚层（epiblast）组织的多能性干细胞。EpiSCs的自我更新能力和多能性的维持主要依赖激活素Activin A(Nodal)/Smad和促成纤维细胞生长因子(FGF/ERK)信号对细胞多能网络进行调控。相比小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells，ESCs）的原始(na?ve)状态，EpiSCs被视为一种初发(prime)状态。EpiSCs无论在细胞形态、发育潜能和多能性维持分子机制上都与ESCs具有本质上的区别。 本研究利用化学成分明确的培养条件，即只添加Activin A和bFGF两种生物活性因子（AF培养条件），在无血清无饲养层细胞的条件下培养小鼠着床后胚龄6.5天(E6.5)的原肠期的上胚层(epiblast)建立AF-EpiSCs细胞系，并对所建立的细胞系进行鉴定。此外，利用本实验室已成熟的诱导体系ABCL，即：Activin A，骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP4）,CHIR99021和小鼠白血病抑制因子（mouse leukaemiainhibitoryfactor，mLIF）进一步诱导AF-EpiSCs，建立更具多能性的干细胞，命名为post-ASCs（post-Advanced Stem Cells）。并从蛋白水平、分子水平和发育潜能等方面检测post-ASCs的多能性。 1.建立AF-EpiSCs细胞系 通过观察AF培养条件下建立的AF-EpiSCs细胞形态学变化、检测细胞生长、染色体核型、免疫荧光、实时荧光定量PCR和体内畸胎瘤分化能力等一系列实验结果，发现利用无血清无饲养层细胞的条件下建系获得的AF-EpiSCs与传统方法建立的EpiSCs的特性基本相同，既具有多能性又具备无限自我更新能力。 2.post-ASCs多能性检测 由AF-EpiSCs诱导获得的post-ASCs克隆形态呈圆球状；与ESCs相比，post-ASCs细胞增殖速度更快；碱性磷酸酶染色呈阳性；诱导后染色体数目未出现异常；表达Oct4,Sox2,Nanog,Klf4等多能性基因，且表达水平与ESCs相似。 3.post-ASCs发育潜能检测 畸胎瘤实验结果显示，post-ASCs在体内能分化形成内中外三胚层组织；通过制备嵌合体的技术，证明post-ASCs能贡献到E13.5的胎儿及生殖嵴，且能产生健康的嵌合体；更重要的是与ESCs相比，post-ASCs还能贡献到胎盘和卵黄囊组织。 综上所述，本实验利用化学成分明确的培养条件建立了AF-EpiSCs，并进一步诱导形成post-ASCs。与ESCs相比，在基因表达水平和发育潜能等方面，post-ASCs更具有发育潜能，是一种新型多能性干细胞系。但是关于post-ASCs发育潜能及多能性维持的机理仍需进一步研究。