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紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是世界上重要的多年生优质牧草,具有产量高、品质好的特点。然而,由于全世界范围内干旱和盐胁迫灾害的日益加剧,其生长范围受到严重限制。随着分子育种的兴起,利用生物工程技术培育适应不良环境的新型作物,这为紫花苜蓿育种在抗旱、抗盐方面提供了理论依据。表皮蜡质是覆盖在植物表面的角质层组成部分。蜡质的积累与防止水分散失相关,有助于抗旱耐盐。而植物蜡质由超长链脂肪酸(Very Long Chain Fatty,VLCFAs)和其他衍生物共同组成。在超长链脂肪酸合成中,主要由复合酶——脂肪酰辅酶A延长酶(Fatty Acyl-enzyme A)催化完成。3-酮脂酰辅酶A合成酶(3-ketoacyl-CoA synthase,KCS)作为复合酶FAE中的限速酶,在下游产物的合成中起关键作用。本文基于RACE技术,从紫花苜蓿中克隆一个基因MsKCS10,从该基因功能、特性方面进行了研究。研究结果如下:1.利用实验室前期基因芯片数据,使用PCR方法从紫花苜蓿叶片中克隆KCS10中间片段序列。采用RACE技术,扩增该中间片段得到基因全长,命名为MsKCS10。测序结果表明,其基因全长(gene full length)为1889bp,开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)共1614bp,能编码氨基酸537个,GeneBank登录号为MK625177。序列比对后发现,该MsKCS10基因与蒺藜苜蓿KCS10基因的同源性为98.36%。利用neighbor-joining方法构建系统进化树,其分析表明MsKCS10基因和蒺藜苜蓿KCS10基因的同源性最高。使用实时定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)分析其在各组织间的表达情况,结果表明:MsKCS10主要在叶和茎中表达,在根中几乎不表达。另外,利用RT-qPCR技术分析MsKCS10基因在9个品种的紫花苜蓿地上部分的表达情况。此外,该基因的转录表达还受逆境胁迫诱导,分析表明,在干旱条件下,MsKCS10上调较快,而在盐胁迫下,上调缓慢。2.构建瞬时表达载体pCAMBIA1300-MsKCS-GFP,使用农杆菌介导法注射在烟草叶片上进行亚细胞定位研究,结果表明,该基因定位在内质网上;构建过表达载体pCAMBIA1301-MsKCS,利用农杆菌介导及叶盘法,侵染烟草,组培后经检测成功获得MsKCS10过表达烟草。过表达植株经自然光干旱胁迫、补充光照干旱和盐胁迫后,其生理生化指标均优于对照组。此外,在烟草叶片中过表达MsKCS10,发现直链烷烃含量和脂肪酸含量增加。且直链烷烃含量的增加主要集中在C31和C33烷烃;脂肪酸含量的增加集中在C20和C22脂肪酸,说明MsKCS10参与烟草蜡质合成,并参与脱羰途径。扫描电镜结果发现,转基因烟草叶片上出现特殊形态的螺旋状蜡质晶体。叶绿素浸出试验数据表明,转基因烟草叶绿素浸出速率小于对照组。同时叶片失水速率试验测定表明,转基因烟草叶片的保水能力优于对照组3.基于GenBank果实特异性启动子PG基因的启动子区域设计特异引物,从Monkey-Maker番茄基因组中克隆番茄果实特异性启动子PG,构建果实特异启动子过表达载体PBI121-PG promoter-MsKCS,使用农杆菌介导法导入Micro-Tom番茄中,经植物组织培养和PCR检验,获得MsKCS10转基因番茄。试验后发现,转基因Micro-Tom番茄较对照组更耐存放。转基因番茄果皮蜡质的直链烷烃及脂肪酸和醛类物质增加。说明MsKCS10在转基因的番茄果实表皮的蜡质合成中,与在烟草叶片中一样,均参与脱羰途径。此外经电镜扫描后发现,转基因番茄表皮出现同转基因烟草叶片表皮相同的特殊蜡质晶体,这可能是由于直链烷烃及脂肪酸含量增加的共同作用;4.使用In-fusion构建过表达载体pCABIAM3301-MsKCS和采用Gateway方法构建得到干扰载体pK7GWIWG2-MsKCS。利用农杆菌介导法,经组织培养和检测,获得MsKCS10过表达紫花苜蓿和MsKCS10-RNAi干扰紫花苜蓿。对MsKCS10过表达紫花苜蓿和MsKCS10-RNAi干扰紫花苜蓿进行电镜扫描后发现,过表达苜蓿叶片表皮蜡质晶体有更浓密的片状蜡质结晶,干扰紫花苜蓿具有较稀疏的片状蜡质结晶。此外,过表达MsKCS10基因苜蓿有更高的C30醇含量、直链烷烃含量;RNAi-MsKCS10转基因苜蓿则表现出下降的C30醇含量、直链烷烃含量,说明MsKCS10在转基因紫花苜蓿叶片的蜡质合成中,既参与脱羰途径又参与酰基还原途径。综上所述,MsKCS10主要响应植物干旱胁迫,并且在转基因烟草叶片和番茄果实表皮的蜡质合成中,均参与脱羰途径。另外,在转基因烟草和转基因番茄果皮都出现螺旋状蜡质晶体沉淀,结合二者蜡质组分,这可能是由于直链烷烃及脂肪酸含量增加的共同作用。而MsKCS10在转基因紫花苜蓿叶片的蜡质合成中,既参与脱羰途径又参与酰基还原途径。