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Macro domain蛋白家族是一类在多种生物中高度保守的蛋白,生物化学特征分析表明大多数Macro domain蛋白能够结合PAR,LRP16属于Macro domain蛋白家族,除在C端含一个单一的Macro domain外,并不含其他的已知的保守性模块。DNA损伤点处感受器 PARP1接受 DNA损伤信号以自身为底物合成局部的PAR网链,LRP16可以通过与 PAR结合参与到 DSB处的 PARP1复合体中呈递DNA损伤早期信号,但是介导 LRP16识别和结合 poly(ADP-ribose)(PAR)的氨基酸位点尚不十分清楚。本研究将寻找 LRP16中与 PAR结合的关键位点,并探讨LRP16与PAR结合的生物学意义。共分三部分内容。 一、LRP16与PAR结合的关键位点的预测及点突变体的构建 目的:分析预测LRP16中可能与PAR结合的关键位点并构建各位点的突变体。方法:通过对 LRP16蛋白结构分析和丙氨酸筛选技术预测 LRP16与 PAR结合的关键位点,并利用重叠 PCR技术,以真核载体 pCDNA3.1-LRP16为模板,构建各位点的突变体。结果:通过分子对接和模拟,显示介导 LRP16与PAR结合的可能氨基酸位点有 D160、I161、N174、G181、V183、D184、S268等,测序结果显示与上述氨基酸位点相应的密码子成功突变为丙氨酸。结论:成功构建了五个LRP16突变体的真核表达质粒。 二、LRP16及其各突变体与PAR结合活性的检测 目的:探讨 LRP16和五个突变体与 PAR结合活性。方法:构建 LRP16五个突变体的原核表达质粒并原核蛋白表达与纯化 LRP16及其五个突变体,斑点杂交实验和免疫荧光体内外分别检测各突变体蛋白与PAR的结合活性。结果:斑点杂交实验显示: LRP16中第160位天冬氨酸和第161位异亮氨酸突变成丙氨酸后,其与 PAR结合能力明显减弱,而当第181位甘氨酸、183位缬氨酸、184位天冬氨酸同时突变为丙氨酸,LRP16与PAR的结合活性只有部分减弱;免疫荧光结果显示 LRP16I161A与 PAR共定位减少。结论:LRP16中第160位天冬氨酸和第161位的异亮氨酸是LRP16与PAR结合的关键位点。 三、LRP16与PAR结合的功能分析及验证 目的:探讨LRP16与PAR结合对LRP16出核、IKK复合体形成、IKKb磷酸化水平的影响,并用抑制LRP16与PAR结合的小分子化合物和PARP酶抑制剂进一步验证。方法:转染 pCDNA3-flag-LRP16( pCDNA3-flag)、pCDNA3-flag-LRP16D160A、pCDNA3-flag-LRP16I161A突变体,在 DNA损伤剂诱导的情况下免疫荧光检测关键位点突变后对 LRP16的出核的影响;免疫共沉淀的方法检测对IKK复合体形成的影响;western blot检测其对 IKKb磷酸化水平的影响。同时用小分子化合物和PARP酶抑制剂处理细胞,western blot检测对LRP16出核的影响及 IKKb磷酸化水平的影响。结果:免疫荧光实验显示转染 pCDNA3-flag-LRP16D160A, pCDNA3-flag-LRP16I161A( pCDNA3-flag-LRP16为对照), LRP16的出核受到抑制;免疫共沉淀实验显示转染 pCDNA3-flag-LRP16D160A, pCDNA3-flag-LRP16I161A(pCDNA3-flag-LRP16为对照),与 PARP1、IKKb、PKR、NEMO等蛋白的相互作用减弱;western blot实验显示转染 pCDNA3-flag-LRP16I161A后,IKKb磷酸化水平减弱(pCDNA3-flag为对照);小分子化合物和 PARP酶抑制剂处理后,LRP16出核减少,IKKb磷酸化水平减弱。结论:当 LRP16中第160位和第161位的氨基酸突变后,LRP16与PAR的结合活性减弱,从而影响 DNA损伤信号的核浆传递,为进一步阐明 LRP16在呈递早期 DNA损伤反应信号中的作用奠定基础。