沙葱萤叶甲Galeruca daurica（Joannis）是一种近年来在内蒙古草原上猖獗成灾的新害虫。本研究旨在克隆沙葱萤叶甲钙结合蛋白（calcium-binding protein,Ca BP）基因,分析其在沙葱萤叶甲不同发育阶段及不同温度下的表达谱,应用RNAi技术明确其对沙葱萤叶甲3龄幼虫发育历期、体重及存活率的影响,为进一步探究其在沙葱萤叶甲生长发育过程中的作用奠定基础。1.沙葱萤叶甲钙结合蛋白基因的克隆及生物信息学分析。应用RT-PCR技术克隆得到4条沙葱萤叶甲Ca BP基因开放阅读框（open reading frame,ORF）全长序列,分别命名为Gd Ca M,Gd CAPSL,Gd Tn Cl和Gd CRT（Gen Bank登录号:MN695412-695415）,ORF全长分别为480,648,516和1 209 bp,分别编码149,215,171和402个氨基酸。同源序列比对和系统发育分析表明,Gd Ca M,Gd CAPSL,Gd Tn Cl和Gd CRT分别与玉米根萤叶甲Diabrotica virgifera virgifera的Ca M,CAPSL,Tn Cl及马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata CRT的氨基酸序列一致性最高,分别为100.0,74.0,88.2和92.5%。2.沙葱萤叶甲钙结合蛋白基因的表达谱分析。q PCR分析表明,4个Ca BP基因在沙葱萤叶甲不同发育阶段及不同日龄成虫中的表达量均存在显著差异,且表达模式不同。Gd Ca M在卵和1龄幼虫期的表达量显著低于其他发育阶段的表达量;Gd CAPSL在卵期的表达量最高,其次为蛹期,而在幼虫期和成虫期的表达量最低;Gd Tn Cl特异性地高表达于成虫期,在其他发育阶段微量表达;Gd CRT在不同发育阶段呈现先降低后上升的趋势,蛹期表达量最高,其次为成虫、卵和1龄幼虫,再次为3龄幼虫,2龄幼虫期表达量最低。Gd Ca M在成虫滞育前（羽化后3 d）表达量较高,进入滞育后（羽化后7 d）表达量降低,在滞育期间（成虫羽化后7～60 d）表达量变化较小,而解除滞育后（成虫羽化后90 d）表达量进一步下调。Gd CAPSL在滞育初期（羽化后10 d）维持在最低水平,进入滞育中后期（羽化后40～60 d）开始回升,滞育解除后又突然下调至最低水平,而羽化后110 d急剧上升至最高水平。Gd Tn Cl在滞育初期（成虫羽化后15～20 d）高表达,进入滞育中后期后（羽化后30～60 d）急剧下降至最低水平,滞育解除后再次上调,但羽化后110 d突然下调至最低水平。Gd CRT在进入滞育后表达量开始逐渐下调,在滞育维持期间（成虫羽化后15～60 d）维持在低水平,滞育解除后又开始上升。温度对除Gd CRT外的其他3个Ca BP基因的表达有显著影响。低于20℃时,Gd Ca M的表达量随温度的降低而升高,但0℃时突然下降;高于20℃时,Gd Ca M的表达量随着温度的升高而上升。Gd CAPSL的表达量随着温度的升高而呈现上升的趋势,25℃时达到最高,然后下降。Gd Tn Cl随着温度的升高,表达量呈现下降的趋势。3.沙葱萤叶甲钙结合蛋白基因的RNA干扰效应。注射ds Ca M、ds CAPSL、ds Tn Cl和ds CRT后,处理组靶标基因Gd Ca M、Gd CAPSL、Gd Tn Cl和Gd CRT较对照组均有不同程度的降低。干扰Gd Ca M后3～4 d、干扰Gd CAPSL后2～6 d、干扰Gd Tn Cl后3～6 d及干扰Gd CRT后4 d,3龄幼虫体重较对照组显著降低;干扰Gd CAPSL和Gd Tn Cl后,蛹重（49.95±4.51 mg和52.8±5.01 mg）较对照组（59.32±4.92mg）显著降低;干扰Gd CAPSL后,3龄幼虫的发育历期（8.45±1.47 d）较对照组（9.95±1.28 d）显著缩短;干扰Gd Ca M、Gd Tn Cl和Gd CAPSL后,3龄幼虫的存活率（88.33±6.24%、45±4.08%和78.33±2.36%）较对照组（96.77±2.36%）显著降低。说明Gd Ca M、Gd Tn Cl和Gd CAPSL在沙葱萤叶甲幼虫生长发育过程中起着重要的调控作用,而Gd CRT作用不明显。