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目的观察弹性蛋白系统在支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia, BPD)小鼠肺组织的动态表达情况,并通过对关键环节之一中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase inhibitor, NE)进行干预,以初步揭示弹性蛋白系统在BPD发生及发展过程中的作用以及可能机制,为寻求有效的BPD防治药物和治疗策略,提高治疗效果提供实验支持和理论依据。方法1.弹性蛋白系统在高氧致新生鼠BPD的动态表达规律利用新生小鼠肺发育的生物学规律与人类肺发育规律相似这一特点,通过将新生12 h C57BL/6小鼠持续吸入高氧(85%)构建BPD动物模型,应用组织病理学、免疫荧光双标法(dual immunofluorescence,DIF)和分子生物学技术等,检测出生后1-21 d正常小鼠和BPD小鼠中弹性蛋白系统的动态变化规律,确定高氧对肺弹性蛋白数量和分布的影响,判断与肺弹性蛋白组装、分解相关蛋白的变化及功能差异,分析与BPD发生的关系。2.弹性蛋白酶抑制剂Elafin对高氧致新生鼠BPD的保护作用建立高氧致新生小鼠BPD模型,通过气道滴注中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂(neutrophil elastase inhibitor, NEI) Elafin干预弹性蛋白系统。将孕19～21 d自然分娩的C57母鼠和新生小鼠,在生后12h内(记为日龄0 d),随机分为3组：(1)空气对照组(Fi02=0.21,Air)；(2)模型对照组(Fi02=0.85,02)。在小鼠日龄3 d、6 d、10 d时,气道滴注10μl/g(小鼠体重)乳酸林格溶液(lactated-ringer solution, L/R);(3)模型给药组(Fi02=0.85,02),在小鼠日龄3d、6d、10d时,将按照10 g1/g(小鼠体重),Elafin 40 ng/g通过气道滴注入小鼠肺组织内。应用组织病理学观察肺组织形态变化、酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunoabsorbent Assay,ELISA)检测肺组织NE活性和尿液锁链素含量；透射电镜(transmission electron microscope, TEM)检测弹性纤维超微结构。3. Elafin对高氧致新生鼠BPD肺TGF-β/Smad2通路的影响建立高氧致新生小鼠BPD模型,给予NEI Elafin(40 ng/g), ELIS A检测肺组织中活化型和总转化生长因子β1(transforming growth factor-β, TGF-β1)的含量；免疫组织化学法(immunohistochemistry,IHC)检测磷酸化Smad2 (phospho-Smad2, pSmad2)在肺组织细胞内的数量与分布；实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction, Q-RT-PCR)检测小鼠肺组织中的弹性蛋白原(tropoelastin)、TGF-β1、TTF-1和HGF-3β基因的表达水平；蛋白印迹法(western Blot, WB)测定pSmad2表达,以及pSmad2占总Smad2的比例。结果1.新生12 h以内的C57小鼠持续85%02暴露21 d,可见弹性蛋白过度无序表达于受损肺泡,次级脊与肺泡数量显著减少,肺泡腔扩大,肺泡结构简单化,肺泡再分化过程受阻。结果提示,高氧致新生小鼠BPD模型建立成功。高氧暴露促进合成、分泌弹性蛋白原的肌成纤维细胞(myofibroblast)显著分化增殖,弹性蛋白原合成、分泌显著增加。促进弹性蛋白原脱氨基转化成熟的赖氨酰氧化酶(lysyl oxidase, Lox)与赖氨酰氧化酶样1(lysyl oxidase-like 1, Loxl-1) mRNA表达上调；ECM蛋白结合受体整合素αv与弹性蛋白共表达增强；以弹性蛋白为最适底物的NE表达增加(P<0.05)。2. Elafin给予,小鼠肺泡数量增加,肺泡腔明显变小；高氧模型组(7.17±2.25)的RAC比Air组(13.75±1.81)显著降低(P<0.01),而Elafin处理组比模型显著增高(10.05±3.12)(P<0.01)；与高氧组相比,Elafin处理组弹性蛋白异常增生量显著减少(P<0.01),次级脊数量明显增加,弹性蛋白在肺泡间隔中沉积减少,而主要在次级脊顶端分布；透射电镜检测显示,与高氧组相比,Elafin处理组小鼠弹性蛋白排列更加规整,与之交联形成弹性纤维的微纤维也排列成正常的条索状。3.高氧会提高小鼠肺活化TGF-β1的含量,而对总TGF-β1的含量无影响, Elafin能够抑制活化TGF-β1比例的升高,而不影响TGF-β1总蛋白的表达；模型组pSmad2表达以及pSmad2占总Smad2蛋白的比例均较空气对照组显著增加(P<0.05),给予Elafin后,两者均显著下降；与空气对照组相比,模型组的tropoelastin,TTF-1以及HGF一3p表达显著增加(P<0.01),而Elafin组tropoelastin,TTF-1以及HGF-3β表达显著较模型降低(P<0.05)。结论1.高氧暴露后,弹性蛋白的合成、组装、沉积和降解等环节间的不协调导致了弹性蛋白表达过度且沉积无序,扰乱了弹性蛋白在初级囊泡壁上的正确沉积从而阻碍次级分隔级的形成,进而阻碍高氧暴露后的肺发育进程。早产儿不完善的弹性蛋白系统参与了BPD的发生发展,并在其中起着非常重要的作用。2.高氧致新生小鼠BPD发生的机制可能与NE表达与活性增加,过度激活TGF-β1-Smad2信号通路有关。3.Elafin给予后能明显改善BPD小鼠肺组织的形态学、弹性蛋白表达分布和超微结构改变,促进肺泡分隔数量的增加,对高氧致肺发育阻滞有明显保护作用。4.抑制NE表达与活性,进而重塑TGF-β1-Smad2信号通路平衡,可能是Elafin对高氧致肺发育阻滞产生保护作用的重要机制之一