动脉粥样硬化(Atherosclerosis,以下简称AS)是一种多因素诱导的慢性炎症性血管疾病,伴随着脂质在血管壁下的沉积,形成成分复杂、不断扩大的易损斑块,一旦斑块破裂,形成的动脉血栓会造成管腔狭窄或堵塞,影响重要组织器官的供血,导致急性冠脉综合征、心肌梗死和脑梗死等恶性临床事件。在招募促AS的炎症细胞过程中,涉及一系列包括白细胞的滚动、粘附、浸润以及向内膜下渗透等过程,这些大都是由趋化因子及其受体所介导,因此趋化因子及其受体在AS研究中一直广受关注,通过基因敲除小鼠和拮抗剂等研究趋化因子及其受体系统在AS中的作用,能够深入研究其致AS作用机制,目前已有专门针对趋化因子受体作为靶点而开发的治疗药物上市,所以这一领域的研究必将对AS干预治疗起到积极作用。研究表明非典型性趋化因子CCRL2(即C-C类趋化因子受体样蛋白2,chemokine CC-motif receptor-like 2)的表达非常广泛,包括小鼠内皮细胞、巨噬细胞、树突状细胞等,并参与许多病理过程。其配体为chemerin,而chemerin还可与的受体CMKLR1结合。尤其是已有报道chemerin和CMKLR1表达在人冠状动脉及小鼠主动脉AS斑块中,然而CCRL2是否促进AS的发展还不清楚。目的我们利用ApoE敲除小鼠建立AS模型,通过CCRL2、ApoE双基因敲除小鼠证明CCRL2敲除对于AS发生发展的影响,阐明CCRL2及其配体chemerin参与AS发生发展过程中的作用机制。方法1.利用ApoE-/-小鼠喂食高脂饲料0、4、8、12周模拟AS发病过程,而后提取主动脉的mRNA和蛋白,通过Quantitative real time-PCR、Western blot、ELISA技术检测AS发生过程中小鼠主动脉内CCRL2及chemerin的表达变化,以及血清中chemerin含量变化。2.对照组CCRL2+/+ApoE-/-和实验组CCRL2-/-ApoE-/-小鼠喂食高脂饲料4、16、24周模拟AS过程,利用苏丹红IV染色,对比两组小鼠整体主动脉以及主动脉弓、主动脉下行支斑块大小,再利用冰冻切片结合油红o染色技术,比较两组小鼠主动脉根部斑块大小。在此过程中,监测两组小鼠12周后的体重及血清中血脂含量在喂食高脂饲料前后的变化。3.对照组ccrl2+/+apoe-/-和实验组ccrl2-/-apoe-/-小鼠喂食高脂饲料12周模拟as过程,使用各类炎症细胞特异性标志(marker)包括巨噬细胞(moma-2)、树突状细胞(cd11c)、t淋巴细胞(cd3)、平滑肌细胞(αsma)等,利用主动脉根部冰冻切片结合免疫荧光方法,检测ccrl2敲除是否影响斑块内各类炎症细胞浸润。利用冰冻切片结合masson染色技术,检测斑块内胶原含量变化,以观察ccrl2对于斑块稳定性的影响。利用rt-qpcr方法检测小鼠主动脉内m1、m2型巨噬细胞释放的细胞因子(m1型:mcp-1、il-1β、il-12,m2型:il-10、cd163、cd301)的含量变化,以间接判断ccrl2对于斑块内m1、m2型巨噬细胞分化的影响。最后体外培养两组小鼠腹腔巨噬细胞,通过ox-ldl诱导巨噬细胞分化为泡沫细胞,利用油红o染色观察ccrl2敲除是否影响巨噬细胞向泡沫细胞分化过程。4.喂食高脂饲料12周的apoe-/-小鼠,利用主动脉根部冰冻切片结合免疫荧光染色技术,检测as斑块内是否有ccrl2、chemerin、cmklr1的表达,并且利用巨噬细胞、树突状细胞、t淋巴细胞、内皮细胞、平滑肌细胞特异性marker(分别为cd68、cd11c、cd3、cd31、αsma)检测ccrl2是否与这些炎症细胞和血管壁中的细胞存在共定位,以明确ccrl2参与as过程是通过哪类细胞发挥作用。5.选取wt小鼠主动脉弓和主动脉下行支的血管,利用rt-qpcr和enface染色技术比较ccrl2在这两个部位表达是否有差异,随后利用小鼠左颈动脉分支结扎模型(pcl模型)造成血管扰动流,取wt小鼠行pcl手术0、24小时后取左、右颈动脉分别利用rt-qpcr和enface染色技术,检测ccrl2在血流紊乱条件下,在血管内的表达变化,以及在血管内皮细胞表面是否能够上调表达ccrl2以促进血管炎症发生。最后取对照组ccrl2+/+apoe-/-和实验组ccrl2-/-apoe-/-小鼠,行pcl手术,并喂食高脂饲料2周后,检测左颈动脉斑块形成情况,以判断ccrl2是否影响血流紊乱条件所诱导的斑块形成。6.对照组ccrl2+/+apoe-/-和实验组ccrl2-/-apoe-/-小鼠通过大腿内侧注射脂多糖lps,造成小鼠股动脉血管急性炎症模型,再通过细胞膜荧光染料dioc6标记白细胞,通过体视显微镜观察ccrl2敲除后对于炎症状态下白细胞在血管内皮细胞表面滚动粘附的变化。随后通过骨髓移植实验,将cmklr1+/+apoe-/-与cmklr1-/-apoe-/-骨髓细胞(5×106个/只)打入经过辐照的apoe-/-小鼠体内,以得到骨髓cmklr1存在或缺失的嵌合体小鼠,利用上述股动脉血管炎症模型,观察敲除造血系统中的cmklr1对于白细胞与血管内皮细胞间的滚动粘附的影响。7.最后利用对照组ccrl2+/+apoe-/-和实验组ccrl2-/-apoe-/-喂食高脂饲料12周模拟as过程,利用冰冻切片结合免疫荧光技术,研究ccrl2敲除后斑块内chemerin含量以及cmklr1+巨噬细胞含量是否变化,以明确斑块内ccrl2与chemerin的相互作用以及对斑块内cmklr1+巨噬细胞浸润的影响。同时通过免疫荧光三色共染技术检测两组小鼠是否在斑块表面和斑块内部形成的ccrl2/chemerin/cmklr1轴。通过elisa方法,检测两组小鼠血清中chemerin含量,以证实ccrl2对于as状态下血清中chemerin含量的调控作用。结果1.针对apoe-/-小鼠,相比喂食高脂饲料之前,在喂食高脂饲料4、8、12周后,ccrl2的mrna表达随着喂食高脂饲料而上调,4周时达到最高点(提高2.85倍),并且在8周、12周维持较高表达的状态,chemerin的mrna表达也会上调表达,同样在4周达到最高点(提高1.72倍),8周维持高表达,12周时恢复正常水平。而ccrl2蛋白表达在喂食高脂饲料后也有显著提高,在8周时达到最高点(提高1.3倍)。检测血清中chemerin的含量,apoe-/-小鼠喂食高脂饲料12周相比wt小鼠chemerin水平明显上调。2.当喂食高脂饲料4、16、24周过后,相比对照组ccrl2+/+apoe-/-,实验组ccrl2-/-apoe-/-小鼠的整体主动脉内斑块面积分别减小32.6%、27.2%、35.2%。针对主动脉弓和主动脉下行支的as斑块形成进行统计,喂食高脂饲料4、16、24周后,主动脉弓斑块面积分别减小38.8%、37.8%、28.6%,而喂食高脂饲料4、16周时实验组小鼠主动脉下行支斑块较对照组并无差别,到喂食24周时出现差别,减小40.8%。并且在16周高脂饲料后,检测主动脉根部斑块形成,实验组ccrl2-/-apoe-/-小鼠较对照组减小47.9%。最后测定两组小鼠喂食高脂饲料前后体重以及血清中血脂含量(包括总胆固醇tc、甘油三酯tg、高密度脂蛋白hdl-c、低密度脂蛋白胆固醇ldl-c)并无差异。3.喂高脂饲料12周后,相比对照组ccrl2+/+apoe-/-,实验组ccrl2-/-apoe-/-小鼠的主动脉根部巨噬细胞浸润减少58.4%,并且血管内m1型巨噬细胞比例下调,m2型巨噬细胞比例上调,而其他炎症细胞如t淋巴、树突状、平滑肌细胞含量以及胶原含量均无差异。最后体外培养两组小鼠腹腔巨噬细胞,ox-ldl诱导形成泡沫细胞,统计泡沫细胞形成油红o染色结果表明ccrl2敲除后影响巨噬细胞向泡沫细胞分化过程。4.喂食高脂饲料12周后,apoe-/-小鼠主动脉根部进行冰冻切片结合免疫荧光结果表明,ccrl2与as斑块内内皮细胞、巨噬细胞、树突状细胞以及t淋巴细胞均存在共定位,而与vsmc无共定位,推测ccrl2可能是通过内皮细胞、巨噬细胞等促进as的发展。5.我们检测到wt小鼠主动脉弓ccrl2的mrna水平比主动脉下行支表达量高,且结合enface染色技术观察到主动脉弓血管内皮表面有大量ccrl2表达,而主动脉下行支则几乎无ccrl2表达。建立pcl的模型24小时后,暴露血流紊乱环境下的左颈动脉内ccrl2的mrna相比在稳流环境下的右颈动脉的表达有明显上调,进一步直接观察左颈动脉血管内皮表面结合enface染色结果表明ccrl2在血管内皮层表达明显比右颈动脉高。最后利用左颈动脉pcl模型加喂食高脂饲料2周所诱导的颈动脉as模型中,相比对照组ccrl2+/+apoe-/-,实验组ccrl2-/-apoe-/-小鼠左颈动脉斑块面积减少44.72%。6.在lps诱导的股动脉血管急性炎症模型中,相比对照组ccrl2+/+apoe-/-,实验组ccrl2-/-apoe-/-小鼠的白细胞在动脉内的滚动减少44.8%,后续骨髓移植实验将cmklr1+/+apoe-/-或cmklr1-/-apoe-/-的骨髓移植到辐照的apoe-/-小鼠体内结果证实cmklr敲除后白细胞在血管急性炎症模型中在股动脉中滚动受到抑制,白细胞滚动数量减少56%。说明造血系统中白细胞cmklr1的缺失影响血管内皮ccrl2对cmklr1+细胞的招募。7.冰冻切片结合免疫荧光染色表明,与对照组ccrl2+/+apoe-/-相比,实验组ccrl2-/-apoe-/-小鼠的主动脉根部在ccrl2敲除后斑块内chemerin含量减少,并且cmklr1+巨噬细胞含量减少78.5%。另外在ccrl2+/+apoe-/-小鼠as斑块表面以及斑块内部均发现ccrl2与chemerin和cmklr1的共定位,而作为阴性对照的ccrl2-/-apoe-/-小鼠as斑块内则没有发现这种共定位存在。推测他们三者在as过程中参与白细胞浸润和炎症细胞相互作用方面起到重要作用。而ccrl2-/-apoe-/-小鼠相比ccrl2+/+apoe-/-小鼠,血清中chemerin含量上调29.8%。说明ccrl2在as状态下,对于血清中chemerin水平具有调控作用。结论1.CCRL2敲除减小动脉粥样硬化模型小鼠的斑块形成。2.CCRL2敲除影响AS斑块内巨噬细胞的浸润及分化。3.血管扰动流条件,诱导血管内皮细胞上调表达CCRL2。敲除CCRL2减小颈动脉结扎AS模型中的斑块形成。4.血管内皮细胞表达的CCRL2可能参与调控局部chemerin的募集,影响CMKLR1+单核/巨噬细胞向内皮下的浸润5.CCRL2参与AS的发生发展是通过与其chemerin、CMKLR1相互作用来完成的。