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目的:基于网络药理学方法探讨朱日亨滴丸体内、体外对大鼠心肌缺血再灌注损伤的干预作用。方法:实验一:基础方(三味檀香散)治疗冠心病的网络药理学研究。通过文献挖掘、多个中药材成分数据库检索收集整理三味檀香散中化学成分并经OB(Oral bioavailability,口服生物利用度)和DL(Drug-likeness,类药性)分析筛选;利用PharmMapper、SWISS、Superpred在线平台预测化合物潜在靶点;OMIM数据库收集冠心病的相关靶标;利用STRING做蛋白互作分析;通过DAVID在线工具对关键靶标做通路富集;应用Cytoscape软件建立该方剂的“药材-化合物-靶标-通路”网络模型,并对网络模型进行拓扑学分析;采用Schrodinger分子对接技术对网络模型分析的部分结果进行验证。实验二:朱日亨滴丸对大鼠心肌缺血再灌注损伤的干预作用及体内实验验证。大鼠随机分为:正常组(Control)、模型组(Model)、广枣组(GZ)、广枣-肉豆蔻药对组(GZ-RDK)、三味檀香散组(SWTX)和朱日亨滴丸组(ZRH)。各给药组连续灌胃给药10天后,除正常组外,其余各组均通过结扎/再灌大鼠心脏LAD(Left coronary anterior descending branch,左冠状动脉前降支)诱导心肌缺血再灌注损伤;II导联心电图观察各组动物心电图变化;腹主动脉采血检测血液生化指标CK(Creatine kinase,肌酸激酶)、LDH(Lactate dehydrogenase,乳酸脱氢酶);Evans Blue/TTC染色分别观察心脏缺血危险区及梗死区;苏木素伊红(HE)染色观察心肌组织病理结构变化;qRT-PCR方法检测网络药理学预测靶标Akt1、Bim、PIK3R1的基因表达;Western blot检测Akt1、p-Akt1、FoxO3a、p-FoxO3a、Bim的蛋白表达。实验三:药物单体抑制H2O2诱导的大鼠H9c2心肌细胞氧化损伤。基于网络药理学的结果,选取朱日亨滴丸治疗冠心病的主要活性单体进行细胞实验验证,900?mol·L-1H2O2诱导建立心肌细胞氧化损伤模型,MTT法观察模型组、模型+PI3K/Akt抑制剂组(LY294002)、模型+各活性单体组[gallogen(G3)、quercetin(G8)、methyleugenol(R2)、macelignan(R7)、santol(T1)]、模型+单体+PI3K/Akt抑制剂组对细胞活性的影响;流式细胞术检测细胞凋亡情况;免疫荧光检测FoxO3a蛋白的分布情况。结果:实验一:网络药理学结果表明,朱日亨滴丸基础方三味檀香散与冠心病发病机制相关的生物学途径主要有应激反应、血管新生、免疫炎症反应、细胞损伤、凋亡及坏死、内分泌调节、细胞分裂增殖、动脉粥样硬化、动脉斑块的不稳定性。经网络拓扑分析发现,三味檀香散治疗冠心病的主要活性成分包括广枣中鞣花酸(gallogen)、诃子次酸[(-)-chebulic acid]等,肉豆蔻中黄樟素(safrole)、肉豆蔻木酚素(macelignan)等以及檀香中α-檀香烯(alpha-Santalene)、檀醇(santol)等化合物;肿瘤抑制因子(Cellular tumor antigen p53)、腺苷受体A1(Adenosine receptor A1)、苏氨酸/丝氨酸蛋白激酶(RAC-alpha serine/threonine-protein kinase)、E3泛素连接酶Mdm2(E3ubiquitin-protein ligase Mdm2)、凝血酶原(Prothrombin)、维甲酸受体RXR-α(Retinoic acid receptor RXR-alpha)等靶点可能是三味檀香散治疗心血管病的关键靶点;通路富集结果显示:PI3K-Akt信号通路(P=1.45E-04)和FoxO信号通路(P=3.75E-04)是其中显著性差异排序靠前的两条信号通路(两者为上下游通路),提示PI3K-Akt-FoxO信号通路参与三味檀香散及朱日亨滴丸的心肌保护作用。实验二:与正常组相比,模型组大鼠心电图,ST段显著抬高(0.40±0.05mV,P<0.01),与模型组相比,各给药组ST段均有不同程度降低,其中三味檀香散组(0.14±0.05mV,P<0.01)、朱日亨滴丸组(0.18±0.05mV,P<0.01)效果优于广枣-肉豆蔻药对组(0.21±0.07mV,P<0.01)和广枣组(0.27±0.06mV,P<0.01);与正常组相比,模型组CK、LDH值显著升高(P<0.01),与模型组相比,广枣、三味檀香散组的CK值显著降低(P<0.05),广枣-肉豆蔻药对和朱日亨滴丸组的CK值较模型组也有所降低但无显著性差异(P>0.05),与模型组相比,除广枣组外,其余各给药组均能显著降低LDH值(P<0.01或P<0.05),其中三味檀香散、朱日亨滴丸组降低较明显;Evans blue/TTC染色结果显示,模型组大鼠心肌缺血、梗死面积最大,各给药组能明显减小缺血、梗死面积,朱日亨滴丸、三味檀香散组优于广枣-肉豆蔻药对、广枣组;HE染色结果显示,各给药组能明显降低模型组心肌细胞排列紊乱,细胞破裂、溶解,组织松散,心肌纤维间隙变大、间质水肿,炎细胞浸润等现象,其中朱日亨滴丸、三味檀香散组心肌结构较完整,损伤较小;qRT-PCR结果显示:与正常组相比,模型组Bim表达显著升高(P<0.01),各给药组均能明显降低Bim的表达水平(P<0.01或P<0.05),朱日亨滴丸组降低最显著(P<0.01);与正常组相比,模型组Akt1、PIK3R1表达微弱(P<0.01),各给药组均能显著增加Akt1、PIK3R1的基因表达水平,其中朱日亨滴丸组Akt1表达最强(P<0.01)、三味檀香散组PIK3R1表达最强(P<0.01),广枣组表达最弱(P<0.01);Western blot结果显示,与模型组相比,各给药组均能显著增加p-Akt1/Akt1、p-FoxO3a/FoxO3a比值,朱日亨滴丸组最显著,三味檀香散组次之;除广枣-肉豆蔻药对组外,其余各给药组Bim蛋白表达与模型组相比均有显著性差异,朱日亨滴丸组最强,三味檀香散及广枣组次之。实验三:PI3K/Akt抑制剂能够逆转药物处理对H2O2诱导的H9c2心肌细胞的保护作用,即与H2O2+单体组相比,H2O2+单体+LY294002组的心肌细胞存活率显著降低(P<0.01或P<0.05),心肌细胞凋亡率明显升高(P<0.01或P<0.05),FoxO3a在细胞质的表达水平降低(P<0.01)。结论:通过对“药材-化合物-靶标-通路”网络拓扑图及相关靶点网络拓扑学参数分析发现朱日亨滴丸基础方三味檀香散治疗冠心病可能与应激反应PI3K-Akt信号通路和FoxO信号通路相关,而后进行了大鼠心肌缺血再灌注损伤体内实验,qRT-PCR、Western blot结果分别验证了朱日亨滴丸能够调节网络药理学预测的Akt1、PIK3R1、Bim的基因表达以及Akt1、p-Akt1、FoxO3a、p-FoxO3a、Bim的蛋白表达;体外采用H2O2诱导的H9c2心肌细胞氧化损伤,也证实了PI3K/Akt/FoxO信号通路参与朱日亨滴丸对氧化损伤心肌细胞的保护作用。