论文部分内容阅读
目的:制备槲皮素磷脂复合物（Q-PC）与PVP K30的固体分散体（Q-SD）,通过改善槲皮素（QT）的理化性质,来增加其溶解度及体外溶出速率;评价Q-SD对干性年龄相关性黄斑变性（AMD）模型小鼠的保护作用,并研究其可能的作用机理。方法:以卵磷脂和PVP K30为载体,采用溶剂法来制备Q-PC及Q-SD,运用红外光谱（FTIR）、紫外光谱进行物相表征,并测定药物溶解度及体外溶出速率,检测其在大鼠体内的血药浓度。氢醌联合高脂肪摄入诱导Nrf2 WT和Nrf2 KO小鼠形成视网膜氧化损伤模型,84只Nrf2 WT小鼠随机分为年龄组、模型组和药物组,干预药物为QT 200mg/kg/d、Q-PC 200mg/kg/d 和 Q-SD 200mg/kg/d（高剂量）、Q-SD 100mg/kg/d（中剂量）、Q-SD 50mg/kg/d（低剂量）组;36只Nrf2 KO小鼠仅分为年龄、模型以及Q-SD 200mg/kg/d（高剂量）的药物组;模型组和药物组小鼠（Nrf2 WT和Nrf2 KO）均予灌胃给药3个月。观察期满,常规处死各组小鼠,摘眼球,去眼前节,电镜观察小鼠视网膜并进行RPE下沉积物的沉积严重程度评分及Bruch膜厚度分析;比色法测定在血清和视网膜组织中ROS、MDA含量和CAT、SOD、GSH-Px活性;Western blot、荧光定量PCR检测Nrf2及其下游抗氧化酶（HO-1、NQO-1及GCL）在各组小鼠视网膜组织中基因和蛋白的表达。结果:1.Q-SD中QT的水溶性和脂溶性均明显改善,远优于QT及Q-PC组（P<0.01）。QT、Q-PC及Q-SD的体外溶出率检出为:31.4%、46.1%和80.2%,QT从Q-SD中的溶出速率及程度明显快于Q-PC和QT。FT-IR光谱与紫外光谱:PVP K30与Q-PC上所有的活泼氢发生了成键相互作用。QT、Q-PC及Q-SD的Cmax分别为:1.517 μg/mL、2.523 μg/mL和4.143μg/mL,差异具有显著统计学意义（P<0.05）;QT、Q-PC及Q-SD的AUC 0-∞为5.461μg·h/mL、8.074μg·h/mL 和 12.015 μg·h/mL,差异具有显著统计学意义（P<0.05）。2.与模型组相比,QT和Q-PC组降低Bruch膜厚度和沉积物严重程度评分均无统计学意义,Q-SD组结果呈剂量依赖性,Q-SD高剂量组效果最突出。3.在年龄和模型组中,Nrf2 KO小鼠血清及视网膜组织中抗氧化酶SOD、GSH-Px、CAT活性均低于Nrf2 WT小鼠（P<0.05）,ROS、MDA含量均高于Nrf2 WT小鼠（P<0.05）。Q-SD 200 mg/kg组可显著降低Nrf2 WT小鼠ROS和MDA水平（P<0.05）,但对Nrf2 KO小鼠无显著影响（P>0.05）。Q-SD 200 mg/kg组可显著提高Nrf2 WT小鼠血清和视网膜组织中CAT、SOD和GSH-Px的活性（P<0.01）,而Nrf2 KO小鼠则作用效果不明显（P>0.05）。4.Nrf2WT小鼠模型组的Nrf2 mRNA转录明显上调（P<0.05）,相较于年龄组;而Nrf2 KO小鼠的Nrf2 mRNA几乎检测不到;与模型组相比,Q-SD 200 mg/kg组显著提高了 Nrf2 WT小鼠的Nrf2 mRNA水平（P<0.01）。此外,Nrf2 WT小鼠模型组的Nrf2核丰度显著增加（P<0.05）,相较于年龄组;与模型组相比,Q-SD 200 mg/kg组明显刺激了 Nrf2核易位（P<0.01）。然而,Nrf2 WT小鼠模型组和Q-SD各剂量组的Nrf2细胞质丰度没有明显改变（P>0.05）。在对Nrf2 KO小鼠视网膜组织细胞核和/或细胞质进行检测,均未发现有Nrf2蛋白表达。5.Real-time PCR检测结果表明,在年龄和模型组中,Nrf2 WT和Nrf2 KO小鼠视网膜中的HO-1、NQO-1和GCL mRNA的转录均存在显著差异（P<0.01）。Nrf2 WT小鼠模型组HO-1、NQO-1和GCL mRNA表达均显著上调（P<0.01）,相较于年龄组;Q-SD 200 mg/kg组显著上调了 HO-1、NQO-1和GCL的转录水平（P<0.01）。与年龄组相比,Nrf2 KO小鼠模型组与Q-SD 200 mg/kg组HO-1、NQO-1、GCL mRNA的转录水平并没有提高,不存在统计学差异（P>0.05）。western blot检测结果表明,相较于年龄组,Nrf2 WT小鼠模型组视网膜组织中NQO-1、GCL的蛋白表达增加（P<0.05）,同时,HO-1蛋白表达明显上调（P<0.01）;其次,Q-SD 200 mg/kg组明显增加了 HO-1、NQO-1、GCL的蛋白表达（P<0.01）。Nrf2 KO小鼠的蛋白丰度是显著低于Nrf2 WT小鼠,在年龄组和模型组中,Nrf2 KO小鼠HO-1、NQO-1、GCL蛋白的表达显著低于Nrf2 WT小鼠（P<0.01）;相较于年龄组,Nrf2 KO小鼠的模型组和Q-SD 200 mg/kg组HO-1、NQO-1、GCL蛋白表达均无统计学意义（P>0.05）。结论:1.QT制备成Q-SD能显著改善QT的溶解性和溶出率。2.QT制备成Q-SD可以显著提高QT的生物利用度。3.QT能减轻干性AMD模型小鼠的视网膜病理损伤。4.QT可以通过调控Nrf2信号通路,来上调Nrf2下游抗氧化酶的表达和抗氧化酶的活性。5.本实验研究结果初步认为Q-SD是对干性AMD有治疗价值的潜力药物。