第一部分血清脂肪细胞因子Proneurotensin、Clusterin与肥胖及早发冠心病的相关性研究目的:冠状动脉粥样硬化性心脏病(Coronary artery disease,CAD)(冠心病)是危害人类健康的慢性病之首。因冠心病所致死亡人数及患病人数较多,且呈逐年上升趋势,因此对人类的健康构成了极大的威胁。随着近年来我国经济的快速发展,人们饮食结构、缺乏锻炼等生活方式的变化,冠心病患者日渐呈年轻化发展。男性小于55岁,女性小于65岁诊断为冠心病,称其为早发冠心病(premature coronary artery disease,PCAD)。鉴于发病较早,远期预后较差,相关研究较少,因此本研究着眼于早发冠心病相关研究。既往研究发现肥胖与冠心病密切相关,脂肪细胞因子在其中起重要作用。Proneurotensin(前神经降压素,PNT)及clusterin(簇集蛋白,CLU)为两种与肥胖密切相关的脂肪细胞因子,但其与早发冠心病关系尚未见报道,因此本研究就脂肪细胞因子proneurotensin及clusterin与早发冠心病相关性进行探究。方法:回顾性分析2011年11月至2016年4月于北京协和医院行冠脉造影术患者3364名,从中筛选男性<55岁、女性<65岁、任一支冠脉狭窄>50%符合早发冠心病诊断标准患者359名。根据年龄、性别、BMI匹配,选取男性<55岁,女性<65岁,冠脉造影任何一支均<50%,符合非早发冠心病诊断标准139名;另选取2009年至2012年于北京协和医院行体检,否认既往冠心病、高血压、糖尿病及高脂血症等慢性病史体检受试者(共193名),作为体检对照组。收集上述691名受试者血常规、肝肾功、血脂、空腹血糖等临床资料,应用ELISA方法检测血清proneurotensin、clusterin水平,进行相关性及线性回归分析。结果:(1)早发冠心病患者肥胖/超重比例高:359名早发冠心病者中,22.0%(79/359)为肥胖,42.1%(151/359)为超重,34.5%(124/359)为正常,1.4%(5/359)为偏瘦。因此早发冠心病超重及肥胖所占比例为64.1%(230/359),明显高于我国肥胖/超重指南报道肥胖/超重患病比例29.9%。(2)血清proneurotensin、clusterin在肥胖、超重及体重正常个体中的变化:肥胖组proneurotensin水平较超重及正常组显著增高[肥胖35.27(8.42,108.12)vs.超重11.52(7.85,85.34)vs.正常 9.14(7.79.74.51),p<0.05]。肥胖组 clusterin 水平较超重及正常组升高,但无统计学差异[肥胖84.15(34.05,141.96)vs.超重44.87(30.74,147.77)vs.正常 47.86(31.77,156.22),p>0.05]。(3)血清proneurotensin及clusterin在体检对照组、非早发冠心病、早发冠心病组中递增:血清proneurotensin于体检对照、非早发冠心病、早发冠心病组逐组升高[PE 9.05(8.53-54.52)vs.NPCAD 12.90(7.49-98.89)vs.PCAD 14.60(7.83-105.89),p<0.05]。血清clusterin于体检对照、非早发冠心病、早发冠心病组呈上升趋势[PE 40.64(28.00-135.91)vs.NPCAD 54.56(31.13-147.92),p<0.05;NPCAD 54.56(31.13-147.92)vs.PCAD 70.25(33.40-162.07),p=0.07]。(4)血清proneurotensin影响因素的多元线性回归分析:血清proneurotensin与女性(r=0.12)、实验分组(PE/NPCAD/PCAD)(r=0.12)、BMI(r=0.10)、总胆固醇(r=0.16)、HDL-C(r=0.09)呈正相关,与LDL-C(r=-0.15)呈负相关(p均<0.05)。多元线性逐步回归分析发现,实验分组(β=0.30,p<0.05)及BMI分组(β=0.14,p<0.05)进入方程,表明proneurotensin与早发冠心病及BMI独立正相关,R2=0.346,矫正决定系数R2=0.121。(5)血清clusterin影响因素的多元线性回归分析:血清clusterin与女性(r=0.13)、实验分组(PE/NPCAD/PCAD)(r=0.13)呈正相关,与总胆固醇(r=-0.12)、LDL-C(r=-0.19)呈负相关(p均<0.05)。进行多元线性逐步回归分析,实验分组(β=0.33,p<0.05)及总胆固醇(β=-0.13,p<0.05)进入方程,表明血清clusterin与早发冠心病呈正相关,与总胆固醇呈负相关,R2=0.393,矫正决定系数R2=0.145。(6)早发冠心病组血清proneurotensin、clusterin相关性分析:早发冠心病组,proneurotensin与糖尿病(r=0.18)、高脂血症(r=0.13)呈正相关(p均<0.05);血清clusterin与高脂血症(r=0.11)呈正相关;服用他汀可降低两者血清水平(r=-0.23及-0.20,均<0.05)。结论:1.血清proneurotensin水平于早发冠心病及肥胖状态显著升高,与早发冠心病及BMI正相关,提示proneurotensin可能为肥胖与早发冠心病的桥接因素。2.血清clusterin水平于早发冠心病及肥胖状态升高,与早发冠心病正相关,与总胆固醇负相关,提示clusterin可能通过负向调控胆固醇,影响冠心病的发生发展。第二部分Neurotensin、Clusterin于炎症状态脂肪细胞中表达情况及其对人脐静脉内皮细胞功能的影响目的:目前认为肥胖是一种慢性炎症反应综合征,脂肪细胞及其相关因子共同组成一个促炎环境,通过影响机体免疫、内分泌、糖脂代谢及循环功能等影响机体代谢与循环系统。脂肪细胞因子不仅可以通过影响传统的危险因素促进动脉粥样硬化的发生,还可以作用于血管壁组织,影响血管内皮功能、改变平滑肌细胞增殖、调节单核/巨噬细胞黏附活性等多环节共同影响动脉粥样硬化的进程。本研究拟应用不同浓度脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)作用于3T3-L1诱导分化脂肪细胞及人脂肪细胞,模拟肥胖脂肪细胞低度炎症状态,进而分析其炎症相关脂肪细胞因子(neurotensin、clusterin、IL6、TNFα)表达水平变化。同时应用人 neurotensin、clusterin及LPS作用于内皮细胞,分析其对内皮黏附、趋化及炎性因子表达影响。方法:(1)①应用含有胰岛素(100μg/ml)、地塞米松(10uM),IBMX(0.5mM)诱导分化培养液,作用于接触抑制3T3-L1前脂肪细胞3天,改用仅含胰岛素(100μg/ml)诱导分化培养液4天,于第8天分别应用1、2、5μg/mlLPS作用于脂肪细胞24h。②应用含有1×10-6mol/L地塞米松、50μg/ml抗坏血酸及100μg/ml IBMX诱导分化培养液,作用于人脂肪间充质干细胞,诱导分化12天为成熟脂肪细胞,加入1、2、5μg/mlLPS作用于脂肪细胞24h。分别提取上述细胞总mRNA,应用RT-qPCR方法检测neurotensin、clusterin、IL-6及TNF-α表达水平。实验重复3次,每次实验均设三孔重复。(2)分别应用人 200μg/ml neurotensin、5μg/ml clusterin、1μg/ml LPS 作用于人脐静脉内皮细胞(HUVEC)24小时后,提取细胞总RNA,应用RT-qPCR方法检测ICAM-1、VCAM-1、IL-6、TNFα、IL-10mRNA表达水平。实验重复3次,每次实验均设三孔重复。结果:(1)不同浓度LPS作用于3T3-L1诱导分化脂肪细胞,对neurotensin、clusterin、IL-6、TNFα表达的影响①neurotensin mRNA表达水平与LPS呈剂量依赖性增高关系,分别为对照组1.75±0.16 倍(p<0.01,1μg/ml 组),2.41±0.28 倍(p<0.01,2μg/ml 组),5.32±0.33倍(p<0.01,5μg/ml组)。提示neurotensin随脂肪细胞致炎严重程度逐渐升高。②clusterin mRNA表达于不同LPS组较对照组表达水平显著上升,分别为对照组2.16±0.06 倍(p<0.01,1μg/ml 组),2.14±0.04 倍(p<0.01,2μg/ml 组),1.77±0.09倍(p<0.01,5μg/ml组)。提示clusterin于脂肪细胞炎症状态表达有所上升。③IL-6 mRNA表达水平于不同浓度LPS组均较对照组表达水平均显著增高,分别为对照组4.99±0.29倍(p<0.01,1μg/ml),4.16±0.07(p<0.01,2μg/ml),4.78±0.24(p<0.01,5μg/ml)。表明LPS对于脂肪细胞致炎模型构建成功。④TNFα mRNA表达水平于不同浓度LPS组较对照组表达水平呈上升趋势,分别为对照组 2.26±0.12 倍(p<0.01,1μg/ml),1.98±0.12(p<0.05,2μg/ml),1.51±0.04(p>0.05,5 μg/ml),表明LPS对于脂肪细胞致炎模型构建成功。(2)不同浓度LPS作用于人脂肪细胞,对neurotensin、clusterin、IL-6、TNFα表达的影响①neurotensin mRNA表达水平于不同浓度LPS作用下均增高,分别为对照组6.17±0.58 倍(p<0.01,1μg/ml 组),5.02±0.60 倍(p<0.01,2μg/ml 组),5.34±0.84倍(p<0.01,5μg/ml组)。提示neurotensin于脂肪细胞炎症状态升高。②clusterin mRNA表达水平于不同浓度LPS组与对照组表达水平相近,分别为对照组 1.10±0.15(p>0.05,1μg/ml 组),0.91±0.13 倍(p>0.05,2μg/ml 组),0.91±0.06倍(p>0.05,5μg/ml组)。提示clusterin于炎症状态表达无明显改变。③IL-6 mRNA表达水平于不同浓度LPS组均较对照组表达水平显著增高,分别为对照组 5.52±0.45 倍(p<0.01,1μg/ml 组),5.58±0.57(p<0.01,2μg/ml 组),3.64±0.53(p<0.01,5μg/ml组)。表明LPS对于脂肪细胞致炎模型构建成功。④TNFα mRNA表达水平于不同浓度LPS组均与对照组无明显差异。(3)LPS、neurotensin及clusterin(human)对人脐静脉内皮细胞黏附、趋化及炎性因子表达的影响①1μg/ml LPS组干预HUVEC黏附、炎性及趋化因子表达水平显著增高。ICAM-1(为对照组 18.01±1.60 倍,p<0.01)、VCAM-1(为对照组 10.11±1.17 倍,p<0.01)、IL-6(为对照组 24.61±2.22 倍,p<0.01)、TNFα(为对照组 20.83±2.47 倍,p<0.01)、MCP-1(为对照组14.80±1.49倍,p<0.01)mRNA相对表达量均较对照组显著升高,表明LPS作用HUVEC炎症状态模拟成功。②200μg/ml neurotensin干预HUVEC黏附、炎性及趋化因子表达水平均显著下降。VCAM-1(为对照组 0.56±0.07 倍,p<0.01)、IL-6(为对照组 0.62±0.05 倍,p<0.01)、TNFα(为对照组 0.55±0.12 倍,p<0.01)、MCP-1(为对照组 0.45±0.04 倍,p<0.01)mRNA水平均较对照组显著下降。③5μg/ml clusterin干预HUVEC炎性及趋化因子表达水平显著下降。IL-6(为对照组 0.77±0.05 倍,p<0.05)、TNFα(为对照组 0.55±0.12 倍,p<0.01)、MCP-1(为对照组0.52±0.03倍,p<0.01)mRNA水平较对照组显著下降。但对于ICAM-1及VCAM-1等黏附因子,无显著影响。结论:1.不同浓度LPS作用于3T3-L1诱导分化脂肪细胞及人脂肪细胞,neurotensin及IL-6 mRNA水平表达均上调,提示neurotensin在脂肪细胞处于炎症状态时表达增加。2.不同浓度LPS作用于3T3-L1诱导分化的脂肪细胞clusterin表达均上调,于人脂肪细胞clusterin表达无上调,提示clusterin于不同脂肪细胞表达不一。3.5μg/ml clusterin及200μg/ml neurotensin使内皮细胞趋化、炎症因子表达显著下降,且neurotensin影响黏附因子的表达,进而对内皮细胞起一定的保护作用。