目的脂肪间充质干细胞(Adipose-derived stem cell,ADSC)因具有诸多的优点如来源充足、取材易、多向分化能力、向受损部位定向归巢的能力以及低免疫原性等,成为再生医学与组织工程研究的热点,已被广泛应用于消化系统、心血管系统和神经系统疾病的临床前试验研究。本实验首先从SD大鼠腹股沟脂肪垫中获取ADSC,通过ADSC细胞移植来研究ADSC对非酒精性脂肪肝动物模型的治疗作用以及利用SPION clusters@PDA纳米探针对ADSC进行标记与活体示踪,观察ADSC在体内的归巢情况,以检测并控制ADSC在体内的生物学行为;最后通过多种培养方法研究ADSC与肿瘤细胞之间的关系以及ADSC在裸鼠体内的成瘤性,来探讨ADSC的生物安全性,以期推进ADSC在肝病治疗中的临床应用。方法本课题首先采用胶原酶消化结合离心分离的方法从SD大鼠腹股沟脂肪垫中获取细胞,通过倒置显微镜、流式细胞仪和诱导分化来鉴定细胞的形态、表面标志物和多向分化能力以证实所收获的细胞是ADSC。采用高脂饮食喂养构建非酒精性脂肪肝动物模型,通过门静脉对动物模型进行ADSC的细胞移植,通过生化检测、病理学检查等方法来分析ADSC是否能改善非酒精性脂肪肝动物模型的肝功能、血脂代谢、及其病理形态。通过合成一种具有超顺磁性的纳米团簇(SPION clusters@PDA)来作为ADSC标记的探针,采用CCK8实验、细胞凋亡实验、流式细胞仪和分化细胞的特殊染色来考察其对ADSC增殖、凋亡、表面标志物和分化能力的影响;纳米材料标记的ADSC通过尾静脉移植到正常雄性ICR小鼠,以观察纳米材料标记的ADSC对脏器的毒性作用;并将纳米材料标记的ADSC通过尾静脉移植到急性肝损伤、急性表皮损伤的动物模型体内,用MRI技术活体观察ADSC在体内的归巢情况。通过常规2D培养、成球培养及3D培养三种方法观察ADSC对肝癌细胞(HepG2与Hcclm3)增殖、凋亡、粘附、迁移和侵袭能力的影响,并检测ADSC对EMT信号通路中E-cadeherin、N-cadeherin、Vimentin、Zeb1表达的影响。最后通过裸鼠成瘤实验来观察ADSC的长期毒性反应。结果根据所分离细胞的特征:(1)细胞培养形态呈成高度均质梭形;(2)阳性表达MSC免疫表型CD29、CD44、CD73、CD90和CD105,阴性表达CD31、CD34、CD45和HLA-DR;(3)具有向成脂肪细胞、成骨细胞和成软骨细胞多向分化的能力,证实了我们所获取的细胞是ADSC。生化和病理检测结果显示,ADSC移植结合饮食调整可进一步明显地降低肝脏指数和血清ALT、TBIL、TC、TG和FA水平,而且会使肝脏的脂质积累恢复到正常水平,进一步扭转肝脏的病理变化。SPION clusters@PDA对ADSC的标记不会影响ADSC的干细胞生物特性、细胞增殖和凋亡;而且标记的ADSC细胞对小鼠的主要脏器无明显的毒性作用。标记的ADSC不仅能运输到正常的肝脏组织,而且在受损的肝脏中聚集得更多,同时还不影响ADSC对肝损伤的治疗效果。三种不同的ADSC条件培养上清均能抑制肝癌细胞的增殖、粘附、迁移和侵袭,而且3D-ADSC-CM能够加强ADSC对肝癌细胞粘附和运动的抑制作用并促进肝癌细胞的凋亡;EMT信号通路中,E-cadherin表达上调而N-cadherin、Vimentin和Zeb1的表达均下调。ADSC皮下接种的裸鼠接种部位无小结节形成,而且心脏、肝脏和肾脏等主要脏器组织也无明显病理改变。结论本实验所获取的ADSC符合国际干细胞和组织干细胞协会提出的MSC标准,可为临床ADSC的采集提供方法依据。而SPION clusters@PDA纳米颗粒是一种生物相容性较好的MRI造影剂,可对ADSC在体内的分布和归巢进行MRI活体示踪,为ADSC临床治疗的疗效和质量控制提供新的思路。3D培养方法能增强ADSC对肝癌细胞生长的抑制作用,为探讨ADSC与肿瘤细胞之间的关系提供新的思路。另一方面,ADSC可有效的抑制肝癌细胞的生长,并通过下调EMT的信号通路来抑制肝癌细胞的侵袭和迁移,而且ADSC在体内的生物安全性较好,无致瘤性,提示ADSC可用于肝癌的治疗。结合饮食调整的ADSC移植治疗也能有效地促进NAFLD大鼠肝脏功能的恢复,逆转NAFLD疾病的进展,可见ADSC在肝病治疗中的应用是积极有效的。