论文部分内容阅读
合浦珠母贝（Pinctadafucata）广泛分布于中国、日本、印度、澳大利亚等围的热带和亚热带海区，是生产海水珍珠的主要贝类之一，具有重要的经济价值。近年来在合浦珠母贝育珠生产中，种苗繁育及养成过程等环节都出现了一系列问题，其中种质资源问题尤为突出。为了促进珍珠产业的可持续发展，合浦珠母贝的种质保护和利用受到重视，不少单位已开始进行合浦珠母贝的良种培育研究。随着分子生物学技术的不断发展完善，分子标记技术不仅用于遗传多样性调查和种群遗传结构分析，也为种质评价、鉴别、溯源提供了条件，同时，也为分子标记辅助育种技术体系的建立奠定了基础。本研究以合浦珠母贝为研究材料，筛选合浦珠母贝的微卫星引物，同时，利用筛选获得的多态性位点对3个养殖群体的主要遗传学参数进行评价，为合浦珠母贝的种质资源保护和合浦珠母贝标记辅助育种提供基础资料。
1.合浦珠母贝微卫星标记的筛选和评价本研究利用已发表文献中的引物、EST文库筛查法和构建微卫星富集文库法3种方法开发了合浦珠母贝微卫星标记。借用已发表文献中引物和EST文库筛查法是最简便、耗费最低的方法，合浦珠母贝目前发表的文献中微卫星引物数量较少，且同样的引物在不同的地理种群中多态性有很大差别，这在很大程度上也限制了此法的应用。EST文库得到的微卫星多态性较差，本研究中利用从EST文库序列设计筛选出的32对引物中等位基因数目多为1-2个，多态性较差。构建微卫星富集文库法是效果比较好的一种，本研究着重优化发展的构建微卫星富集文库法，用生物素标记的（CA）15、（AG）12、（ACA）15、（GATA）8、（GATT）75个探针进行磁珠富集，随机挑选500个克隆进行PCR筛选，得到138（27.6％）个候选克隆，测序分析发现130个克隆含有微卫星重复单元。进一步通过序列比对，最终获得109个具有特异微卫星序列的阳性克隆，其中包含179个微卫星DNA结构域。获得的微卫星序列中属于完全型序列的有154条，不完全型重复型序列有19条，复合型重复序列有6条。序列长度为70-490bp，平均295bp。微卫星核心序列两碱基重复3到39次，绝大多数序列重复次数大于10。基于微卫星两端的侧翼序列设计并获得了13对能够在合浦珠母贝基因组有效扩增的微卫星引物。其中8对在种群中（n=32）具有扩增多态性，其多态信息含量PIC值在0.239-0.787之间，平均为0.653；等位基因数在2-9个之间，平均为6.5个；观测杂合度介于0.22-0.56之间，平均为0.43；期望杂合度的变化范围为0.25-0.83，平均为0.69。
2.合浦珠母贝不同群体遗传结构的微卫星分析以合浦珠母贝广东徐闻金碧公司养殖场、广西北海营盘镇养殖场和南海水产研究所海南实验基地3个养殖群体为研究对象，利用8个微卫星位点M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8的引物进行了遗传多样性和种群遗传结构分析，统计分析了等位基因数、基因频率、杂合度、平均多态信息含量等遗传参数，并检测了群体是否符合Hardy-Weinberg平衡的状况。结果显示：8个微卫星标记位点在3个群体中共检测到58个等位基因，观测等位基因数在2-9个，平均有效等位基因数3.72-5.06，平均观察杂合度0.41-0.56，平均期望杂合度0.67-0.75，3个群体的平均多态信息含量PIC值在0.62-0.70之间，全部为高度多态（PIC≥0.5），数据分析结果表明：南海水产研究所海南实验基地群体的遗传多样性最高，广西北海营盘镇养殖场群体遗传多样性最低。从总体上说，合浦珠母贝养殖群体目前仍具有较高的遗传多样性，遗传信息丰富，遗传变异大，可以作为良好的育种材料。