第一部分MSC的分离培养及GATA-4基因的转染目的：基因修饰骨髓间充质干细胞(MSCs)是增加细胞抗缺氧和心肌分化的新方向。分离、培养和纯化大鼠MSC，以逆转录病毒为载体将GATA-4基因转染MSC，建立稳定的GATA-4基因修饰的MSC细胞模型。方法：从雄性大鼠骨髓中分离MSC，培养至第3代MSC，经pMSCV逆转录病毒表达系统转染GATA-4基因(MSCGATA-4)，对照组为仅表达GFP的空质粒组（MSCNull）。通过实时定量聚合酶链反应(Real-time quantitative polymerase chainreaction, Real-time PCR)、Western blot印迹和免疫组化的方法鉴定GATA-4基因转染的效果。结果：MSCGATA-4组GATA-4mRNA和蛋白表达明显高于对照组MSCNull，P<0.05。Real-time PCR数据显示，MSCGATA-4组GATA-4mRNA的表达是MSCNull组的258倍。通过免疫组化检测发现，虽然MSCGATA-4组和MSCNull组的GFP都显示阳性，但只有MSCGATA-4组细胞核呈GATA-4阳性表达。结论：本研究成功建立了GATA-4基因修饰MSC的培养系统，为进一步探讨GATA-4在MSC的心肌分化及血管新生中的作用奠定了基础。第二部分GATA-4基因转染促进MSC向心肌分化的研究及机制探讨目的：GATA-4是心肌转录因子，在心肌分化中起着重要的作用。我们从体外研究了GATA-4转染MSC是否促进其分化为心肌样细胞。方法：（1）分离和培养新生大鼠心室肌细胞（CM）。并通过光镜、透射电镜和免疫组化鉴定心肌细胞；（2）MSCGATA-4与CM共培养1周，通过Real-time PCR和Western blot检测其心肌基因BNP、α-actinin和Islet-1的表达情况。（3）通过免疫荧光α-actinin染色法检测MSCGATA-4组和MSCNull组的心肌分化情况。（4）通过膜片钳技术检测MSCGATA-4组和MSCNull组细胞的电生理特点：分别记录内向整流性钾流（Ik1）、瞬时外向性钾流（Ito）、延迟整流性钾流（IKDR）、L-型钙离子流（ICa-L）、TTX敏感的钠离子流（INa., TTX）和动作电位（AP）的表达，（5）通过流式细胞仪器检测MSCGATA-4组和MSCNull组心肌分化率的情况。（6）用Microarray、Real-time PCR和Western blot检测MSCGATA-4组和MSCNull组胰岛素样生长因子结合蛋白（Insulin-Like Growth Factor Binding Protein, IGFBP-4）的表达。（7）为了研究IGFBP-4对GATA-4调节MSC的心肌分化作用，我们进行了MSCGATA-4组的IGFBP-4基因敲除，以scrambled siRNA作为阴性对照组。并用Real-time PCR和Western blot检测IGFBP-4基因敲除效果。（8）观察敲除IGFBP-4基因后，GATA-4对MSC心肌分化的作用。结果：（1）MSCGATA-4组的心肌基因BNP、α-actinin和Islet-1的表达明显高于对照组（转染空质粒组MSCNull）(P<0.05)。（2）MSCGATA-4组记录到表达高水平的Ik1、Ito、IKDR、ICa-L和INa., TTX。与MSCNull组相比较，它们的电流密度明显增加，P<0.05。（3）MSCGATA-4与CM和共培养时，部分细胞记录到低幅度的动作电位（AP）；而MSCNull组没有记录到AP。（4）共培养7天后，部分GFP+的MSC细胞表达α-actinin。MSCGATA-4组（34％±4％）的阳性率与MSCNull组（15％±2％）相比较，明显增加，P<0.05。（5）通过Microarray、Real-time PCR和Western blot检测，IGFBP-4表达在MSCGATA-4组较MSCNull组明显增加，P<0.05。（6）经siRNA敲除IGFBP-4基因后，定量PCR显示IGFBP-4-siRNA-MSCGATA-4中IGFBP-4基因的表达仅是MSCGATA-4组的38%(P<0.05)，Western blot显示IGFBP-4-siRNA-MSCGATA-4细胞中IGFBP-4蛋白表达明显减少，只有MSCGATA-4组的28%(P<0.05)。（7）IGFBP-4基因敲除后，IGFBP-4-siRNA-MSCGATA-4细胞中心肌基因(BNP、α-actinin和Islet-1)的表达，与MSCGATA-4组相比较，显著减低，P<0.05。（8）通过流式细胞仪检测各组MSC的心肌分化率。结果显示，MSCGATA-4组的心肌分化率(34.09±4.65%)明显比MSCNull组心肌分化率(14.54±1.62%)增高，P<0.05。而IGFBP-4基因沉默以后，沉默组（IGFBP-4-siRNA-MSCGATA-4）的心肌分化率(16.87±1.98%)明显比MSCGATA-4组低（P<0.05）。（9）功能研究表明当敲除IGFBP-4基因时，MSCGATA-4组分化潜能被降低。结论：GATA-4过表达可以促进MSC分化为心肌样细胞，其机制可能与IGFBP-4的表达上调有关。第三部分GATA-4基因转染促进MSC新生血管形成的体外和体内研究目的：干细胞移植入受体心脏后，可以释放可溶性因子，增加心肌修复和血管再生。我们假设GATA-4过表达于MSC中可以通过增加其旁分泌作用，促进血管新生和细胞存活，从而改善心肌梗死后的心肌再生。方法：（1）用ELISA方法检测不同组细胞（MSCNull和MSCGATA-4组）上清中生长因子VEGF、IGF-1和b-FGF的表达。（2）用定量PCR方法检测不同组细胞中VEGF、IGF-1和b-FGF基因的表达情况。（3）为了检测细胞在缺氧条件下抵抗作用，细胞分别被缺氧不同时间24、48和72小时，用MTT观察细胞的增殖情况。（4）用绿色荧光的PKH67标记人脐静脉内皮细胞（HUVEC）；用不同组MSC细胞培养上清刺激HUVEC，体外观察不同组的毛细血管样结构的形成。同时加入VEGF或和IGF-1的中和抗体，孵育12小时，观察对毛细血管样结构形成的影响。（5）把HUVEC细胞球体接种到3D立体胶培养系统，加入细胞培养上清，同时加VEGF或和IGF-1的中和抗体作用24小时，观察对球体出芽的数量和总长度的影响。（6）用结扎冠状动脉左前降支的方法建立雌性大鼠的急性心肌梗死模型，各组MSC被注射到梗死周边区域的心肌内。（7）用定量PCR检测雌性大鼠中雄性Sry基因的表达，检测缺血心肌中MSC的存活。（8）用超声心动图评估心肌功能，同时检测新生血管的形成及梗死面积等。结果：（1）定量PCR的结果显示，MSCGATA-4组中VEGF和IGF-1基因的表达明显比MSCNull组表达高，P<0.05。（2）ELISA结果显示，在MSCGATA-4上清中VEGF和IGF-1的分泌明显比MSCNull上清高，P<0.05。b-FGF的分泌没有显著性差异，P＞0.05。（3）细胞缺氧48和72小时时，MTT细胞增殖明显减小。而GATA-4过度表达可以部分预防MTT的减小。（4）用MSCGATA-4组上清处理的HUVEC，与对照组MSCNull相比较，显著增加了血管样结构的形成和HUVEC的迁移（通过每个球体出芽的数量和出芽的总长度来评估），P<0.05。将中和抗体VEGF、IGF-1分别或同时加入到MSCGATA-4组中，可以明显减少MSCGATA-4组新生毛细血管的形成，与不加抗体的MSCGATA-4组相比较，P<0.05。（5）通过Sry基因的检测，在MSCGATA-4治疗组的梗死及梗死周边区，Sry基因的表达明显增高；与MSCNull组或MSCbas组相比较，有显著性的差异，P<0.05。可见过度表达GATA-4可以明显增加MSC在缺血心肌的存活率。（6）通过心脏超声检查，用MSCGATA-4移植治疗的动物组心功能明显改善；与MSCNull组或MSCbas组相比较，有显著性的差异，P<0.05。（7）通过组织化学染色可见，MSCGATA-4组血管密度增加，心梗面积降低；与MSCNull组或MSCbas组相比较，有显著性的差异，P<0.05。结论：GATA-4过表达于MSC，可以增加缺血心肌的MSC存活和新生血管的形成，是心肌梗死的一个有效的治疗方法。