1研究背景与目的食管癌是世界上最常见的六大恶性肿瘤之一,我国河南、河北和山西三省交界的太行山地区是世界上食管癌高发区。我们在该地区多年现场普查发现吸烟和低体重指数与食管癌的发病相关。研究报道遗传因素对吸烟、体重指数(BMI)的影响起主要作用,大量研究发现吸烟可导致BMI降低,但也有报道吸烟可致BMI升高。不同的遗传背景和环境因素可能是造成这一差异的原因。同卵双胞胎两人具有相同的遗传背景,可以极大地排除遗传背景差异造成的影响。另一方面,DNA甲基化是环境因素和遗传因素交互作用的结果,在疾病发生过程中起很大作用,包括肿瘤的形成。DNA甲基化和组蛋白修饰等表观异常改变,可影响调控细胞生长、分化、转化和凋亡基因的转录。大量研究报道肿瘤抑制基因启动子区异常甲基化,在肿瘤发生过程中是一个早期频发事件,常导致基因表达失活。肿瘤累及器官分泌的相关体液(外周血、唾液、痰等)中可以检测到肿瘤组织中相关基因启动子的异常甲基化。这一发现为肿瘤早期诊断提供了重要研究信息。由于,肿瘤相关基因的异常甲基化有明显的基因-肿瘤类型相关性。传统甲基化检测手段,已不能满足研究需要。采用高通量检测手段进行恶性肿瘤标志物的筛选,势在必行。全基因组表观测序已成为可能,但需要巨大的人力、物力和财力支持。高通量芯片检测技术以检测通量高、位点明确、试验周期短、成本低廉等优点成为现阶段肿瘤标志物筛选的首选。传统恶性肿瘤标志物的筛选,由于研究对象存在显著的遗传背景差异,给研究带来很大的干扰。本研究通过对高发区健康人群和双胞胎人群进行吸烟行为和体重指数等基础数据的调查,初步分析环境与遗传因素对吸烟行为和BMI的影响及吸烟对BMI的影响,为高发区食管癌发病机制研究提供基础数据；利用同卵双胞胎食管癌家系成员外周血DNA,采用甲基化芯片检测技术,进行差异甲基化基因筛查,为阐明甲基化在食管癌发生中的作用提供理论依据,并为食管癌早期诊断提供候选指标。2材料与方法2.1研究对象1492对双胞胎和7696例健康普查人群均来自河南食管癌高发区(安阳、新乡、鹤壁)；所有研究对象均经过体检和问卷调查排除各种慢性消耗性疾病和恶性肿瘤。来自食管癌高发区的双胞胎食管癌家系,该家系连续三代内5名食管癌患者(其中有一对同卵双胞胎同患食管癌)和7名健康成员。2.2问卷调查和体格检查对上述地区的双胞胎和健康人群进行问卷调查和家访,内容包括：一般情况、疾病史、吸烟史、生活习惯和一般体格检查。双胞胎调查内容还包括：相似度、双胞胎家族史、指纹检查、食管癌家族史、家系图等。测量身高体重时空腹,脱掉鞋子。双胞胎每人抽取5ml空腹抗凝血。双胞胎食管癌家系成员每人抽取5ml空腹抗凝血,而后行电子胃镜检查并取活检进行病理学诊断。2.3卵型鉴定采用相似诊断法和短串联重复序列进行鉴定。2.4DNA提取及甲基化芯片扫描使用Infinium HumanMethylation450BeadChip甲基化芯片,进行甲基化位点检测。采用QAGEN外周血DNA提取试剂盒提取DNA。 DNA质检合格后-80℃冷藏备用。DNA经亚硫氢酸盐处理,扩增,断裂、沉淀、重悬,芯片杂交、洗涤,单碱基延伸,芯片染色、保护、扫描等步骤完成甲基化位点扫描。2.5统计学处理高发区双胞胎和健康普查人群资料,采用SPSS18.0进行T检验、χ2检验和秩和检验,检验水准α=0.05。GenomestudioV2011软件对芯片扫描数据行初步分析,将磁珠数目<3和Detection Pval>0.05的位点滤除,利用SAS软件对数据进行分组分析,筛选标准：食管癌患者与正常对照的平均甲基化水平差值的绝对值≥0.1且P<0.0001。3结果3.1双胞胎吸烟行为与BMI变化双胞胎BMI遗传度为0.781,男性双胞胎吸烟行为遗传度为0.142。男性双胞胎吸烟与不吸烟组BMI均值和BMI分级比较均无差异(P>0.1);一般男性人群吸烟与不吸烟组BMI均值和BMI分级比较均有统计学差异(P<0.001),吸烟组的低体重率大于不吸烟组,吸烟组的超重和肥胖率低于不吸烟组。健康人群男、女性吸烟率分别为56.7%和1.0%；男、女性低体重、超重和肥胖率分别为5.0%、29.1%、6.5%和8.0%、29.4%、8.7%。3.2双胞胎食管癌家系甲基化分析食管癌患者与正常成员间共发现58个差异甲基化CpG位点,其中33个CpG位点定位到MYOM2、ARHGEF10、VCX3B、GDPD1、MBP、BNIP3、MIR886、 RPH3A、ADAMTS12、STK32C、NTM、DNM1L、DDX12、PQLC1、CNDP1、 CNDP2、KLK3、MGC87042、TBCD等19个基因上。4结论4.1双胞胎烟行为与BMI变化BMI主要受遗传因素的影响,而遗传因素对吸烟行为的影响不明显；长期大量吸烟可能引起BMI降低；食管癌高发区健康人群超重和肥胖率、男性吸烟率均明显高于全国水平。4.2双胞胎食管癌家系甲基化分析双胞胎食管癌家系甲基化分析发现6种频发甲基化的基因,即MBP、BNIP3、 DNMlL、ADAMTS12、KLK3和MIR886,为进一步筛选和建立高危人群筛查和早期发现的候选分子指标提供了重要线索。