自然界中通过传统的培养分离方法只能得到微生物总量的0.01%-10%,而90%-99%的微生物处于活的但不可培养的(viablebutnon-culturable,VBNC)状态,严重阻碍了人们对微生物资源的发掘及利用。研究表明通过复苏促进因子(resuscitation promoting factor,Rpf)和最大可能数法(most probable number,MPN)培养系统结合平板稀释法可提高废水等特殊污染环境中微生物的分离丰度,VBNC菌群的形成是影响环境污染物质生物降解成效的限制因子。本课题以难生物降解造成严重环境问题的制药废水为研究对象,探索制药废水中未培养或处于VBNC状态细菌的组成,解明系统发育学关系,为揭示制药废水等特殊污染环境功能菌群的组成及利用提供新的途径和科学依据。首先对 Micrococcus luteus IAM 14879(=Micrococcus luteus NCIMB 13267,藤黄微球菌)内含有672 bp的rpf基因(对应223个氨基酸)进行克隆表达,纯化后最终获得了浓度为2mg/mL的Rpf重组蛋白,分子量为:29-30KDa,20%(BL21-rpf)工程菌摩尔浓度为1.63X104pmol/L。基于克隆的Rpf重组蛋白添加进MPN培养体系中,对制药废水样品进行VBNC资源菌的复苏分离的可培养化研究。共获得了 28株细菌,其中23株属于VBNC细菌,均登录至国际基因库DDBJ,由此建立起了一个小型制药废水VBNC菌种资源库,且丰富了实验室VBNC菌种资源。所分离23株VBNC菌分属14个属:Aminobacter(氨基杆菌属)、Xanthobacter(黄色杆菌属)、Rhizobiu(根瘤菌属)、Alcaligenes(产碱杆菌属)、Candidimonas(念珠菌属)、Acidovorax(嗜酸菌属)、Comamonas(丛毛单胞菌属)、Pseudomonas(假单胞杆菌属)、Enhydrobacter(嗜热杆菌属)、Pseudoxanthomonas(假黄单胞菌属)、Micrococcus(微球菌属)、Microbacterium(微杆菌属)、Leucobacter(亮杆菌属)、Gordonia(戈登氏菌属)。其中经复苏活化、达新种水平的VBNC菌株ZYSR67-ZT进行系统发育特性、表型特征、生理生化特性、化学分类、基因型鉴定、DNA-DNA杂交等多相分类学及其系统学解析,并经国际菌种保存机构CGMCC和JCM保存(保藏号:CGMCC 1.15498T,JCM31306T)。研究表明菌株ZYSR67-ZT属于Pseudomonas属内的新种细菌,命名为Pseudomonas pharmacopolae sp.nov.。揭示了 Rpf 复苏制药废水中 VBNC 菌种资源的多样性,表明了 Rpf不仅对高G+C革兰氏阳性菌有很好的复苏促进作用,对低G+C革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌也具有一定的复苏作用。为未培养微生物及菌种资源多样性的开发和应用提供了新的途径和可能。