目的:急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一类造血干细胞恶性克隆性疾病,是严重威胁人类健康的疾病。AML主要的治疗方法为化疗,近年来成人AML患者经标准“3+7”化疗方案治疗后,完全缓解率在70%-80%。同时由于微小残留病灶(MRD)的存在,缓解后复发是AML病人的危险因素。只有近20%-30%的AML病人可以获得无病生存[1]。异基因造血干细胞移植是治疗AML最有效的方法,由于患者客观条件限制较多(如供着来源、经济状况)等多方面的因素,目前能够接受造血干细胞移植的AML病人为少数。因此寻找新的靶向药物提高化疗药物的效果是我们不断探索的领域。急性髓系白血病的发生与细胞遗传学、分子遗传学改变有密切关系,研究发现大多数急性髓系白血病(AML)患者中存在2种或2种以上基因异常甲基化,DNA甲基化在白血病中广泛存在,启动子Cp G岛超甲基化导致的抑癌基因失活与白血病的发生和肿瘤细胞化疗药物抵抗密切相关[2]。地西他滨(decitabine,DAC),又称为5-氮杂-2’-脱氧胞苷,是一种胞嘧啶核苷类似物,为特异的DNA甲基化转移酶抑制剂,是目前研究较多的甲基化抑制剂,可通过逆转Cp G岛甲基化,使多种因甲基化而失活的抑癌基因重新表达,抑制肿瘤细胞生长而达到治疗肿瘤的目的[3]。三氧化二砷(arsenic trioxide,AS2O3)是传统中药砒霜的有效成分之一,是治疗急性早幼粒细胞白血病的经典药物之一,该药物通过诱导白血病细胞分化及凋亡两条途径发挥其治疗作用,随着对该药物的不断研究,现在逐渐应用于其他类型的恶性血液病的治疗中[4]。目前去甲基化药物不断应用于临床,不仅应用于骨髓增生异常综合征的患者,同时针对老年AML、复发、难治的AML患者,有一定的效果。研究新的靶向药物,以提高药物疗效并延长无病生存期是目前研究的重要课题。本实验研究DAC、AS2O3对HL-60细胞(人急性髓系白血病细胞株)增殖、凋亡的作用以及对HL-60细胞端粒酶的基因及蛋白表达水平变化的的影响,探讨去甲基化药物对AML的作用机制,旨在为今后临床用药提供更多的理论依据。方法:选取HL-60(人急性髓系白血病)细胞株为研究对象,实验随机分组:设置未加药物空白对照组,单药DAC组(1μmol/L、10μmol/L、50μmol/L),单药AS2O3组(1.25μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L)、DAC联合AS2O3组(10μmol/L+2.5μmol/L、10μmol/L+5μmol/L、50μmol/L+2.5μmol/L、50μmol/L+5μmol/L),DAC(50μmol/L)预处理+AS2O3组(1.25μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L)。根据不同浓药物度作用HL-60细胞后,检测不同时间增殖、凋亡的作用以及对端粒酶基因及蛋白表达水平的影响。每组实验重复3次。1用CCK8法筛查药物浓度,检测不同药物浓度作用HL-60细胞24h、48h、72h后的增殖抑制率;2用流式细胞术(FCM)检测不同药物浓度作用HL-60细胞24h、48h、72h后的凋亡率;3用RT-PCR法检测不同药物浓度作用HL-60细胞48h后端粒酶的h TERT m RNA表达水平的变化;4用Western Blot法检测不同药物浓度作用HL-60细胞48h后h TERT的蛋白表达水平的变化;5用SPSS 21.0统计软件进行统计学处理。所有数据用3次独立实验的平均值表示,实验结果均采用均数±标准差(X±S)表示;两组比较应用t检验,多组比较应用方差分析,P<0.05有统计学意义。结果:1 DAC、AS2O3单药对HL-60细胞株增殖抑制率的检测。1.1不同浓度DAC、AS2O3单药作用于HL-60细胞24h、48h、72h后,单药DAC、AS2O3增加药物浓度和作用时间延长,可增加增殖抑制率。单药DAC作用HL-60细胞后,增殖抑制率由(10.85±2.04)%增加到(56.01±2.04)%,单药AS2O3作用HL-60细胞后,增殖抑制率由(14.55±1.68)%增加到(85.09±3.67)%。各药物处理组之间比较差异有统计学意义(P=0.00)。说明DAC、AS2O3单药均对HL-60细胞有抑制增殖的作用,并呈时间-剂量依赖性。(图1,图2,表1,表2)1.2 DAC联合AS2O3对HL-60细胞作用24h、48h、72h后,不同时间段两药联合作用HL-60细胞,增加药物联合浓度,其增殖抑制率由(35.68±1.98)%增加到(94.89±1.02)%,各联合处理组与单药处理组比较增殖抑制率明显增高,比较有统计学意义(P=0.00)。说明DAC联合AS2O3对HL-60细胞的抑制作用优于单药。(图3,表3)1.3经DAC(50μmol/L)预处理后,不同浓度AS2O3对HL-60细胞作用24h、48h、72h后,增加药物浓度和延长作用时间,可增强增殖抑制率,增殖抑制率由(26.98±0.67)%增加到(93.10±0.80)%,与AS2O3单药组比较增殖抑制率显著增加,各药物处理组间及与AS2O3单药组之间比较差异具有统计学意义(P=0.00)。说明DAC预处理可以增强AS2O3对HL-60细胞的增殖抑制作用。(图4,表4)2 DAC、AS2O3单药对HL-60细胞株凋亡的影响2.1单药DAC、AS2O3作用于HL-60细胞24h、48h、72h后,凋亡率逐渐升高。单药DAC对HL-60细胞凋亡率由(7.61±1.02)%增加到(36.33±0.51)%,单药AS2O3对HL-60细胞凋亡率由(9.80±0.26)%增加到(40.56±0.90)%。各药物处理组间以及与空白对照组之间比较差异有统计学意义(P=0.00)。说明DAC、AS2O3单药能够诱导HL-60细胞凋亡,并呈时间-剂量依赖性。(图5,表5,表6)2.2 DAC联合AS2O3对HL-60细胞作用24h、48h、72h后,凋亡率由(18.00±1.37)%增加到(57.76±0.61)%,各联合组与单药组比较凋亡率显著增加,且差异具有统计学意义(P=0.00)。说明DAC联合AS2O3对HL-60细胞诱导凋亡具有协同作用。(图5,表7)2.3经DAC(50μmol/L)预处理后,不同浓度的AS2O3对HL-60细胞作用24h、48h、72h后,凋亡率随药物浓度的增加和作用时间的延长而增加,凋亡率由(17.93±0.55)%增加到(60.96±0.70)%,较AS2O3单药组凋亡率明显增加。各AS2O3浓度经DAC预处理后与AS2O3单药组比较差异有统计学意义(P=0.00)。说明DAC预处理可以增强AS2O3对HL-60细胞诱导凋亡的作用。(图5,表8)3 DAC、AS2O3对HL-60细胞内端粒酶h TERT m RNA表达水平变化的影响3.1不同浓度DAC、AS2O3单药对HL-60细胞作用48h后,增加药物浓度,端粒酶h TERT m RNA表达水平有下降。单药DAC(0μmol/L、1μmol/L、10μmol/L、50μmol/L),对h TERT m RNA的表达量由0.993±0.007下降到0.578±0.004;单药AS2O3(0μmol/L、1.25μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L)对h TERT m RNA的表达量由0.993±0.007下降到0.657±0.034。各处理组间h TERT m RNA比较,差异具有统计学意义(P=0.00)。说明DAC、AS2O3单药能够降低HL-60细胞内端粒酶h TERT m RNA基因的表达水平,呈剂量依赖性。(图6,表9,表10)3.2不同浓度的DAC联合AS2O3对HL-60细胞作用48h后,增加联合组药物浓度,对h TERT m RNA的表达量由0.528±0.022下降到0.213±0.023。各处理组之间h TERT m RNA表达水平差异具有统计学意义(P=0.00)。说明DAC联合AS2O3能够增加HL-60细胞内端粒酶h TERT m RNA的表达水平,且两者具有协同作用。(图6,表11)3.3经DAC(50μmol/L)预处理后,不同药物浓度的AS2O3对HL-60细胞作用48h后,增加药物浓度,h TERT m RNA的表达量由0.161±0.022下降到0.065±0.008,较AS2O3单药组比较表达水平显著下降,h TERT m RNA各处理组间及与单药AS2O3比较h TERT m RNA差异均具有统计学意义(P=0.00)。说明DAC预处理可以增加AS2O3对HL-60细胞内端粒酶h TERT m RNA的抑制作用。(图6,表12)4 DAC、AS2O3对HL-60细胞端粒酶内h TERT蛋白表达水平变化的影响4.1不同浓度DAC、AS2O3单药对HL-60细胞作用48h后,随着药物浓度的增加,端粒酶h TERT的蛋白表达水平有下降。单药DAC(0μmol/L、1μmol/L、10μmol/L、50μmol/L)对h TERT的蛋白相对表达量由1.046±0.073下降到0.576±0.063;单药AS2O3(0μmol/L、1.25μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L)对h TERT的蛋白相对表达量由1.046±0.073下降到0.426±0.014。各处理组间及处理组与空白对照组之间比较差异具有统计学意义(P=0.00)。说明DAC、AS2O3单药能够降低HL-60细胞内端粒酶h TERT蛋白的表达,并呈剂量依赖性。(图7,表13,表14)4.2不同浓度的DAC联合AS2O3对HL-60细胞作用48h后,随着药物浓度的增加,对h TERT的蛋白相对表达量由0.674±0.016下降到0.111±0.015,且差异具有统计学意义(P=0.00)。说明DAC联合AS2O3能够抑制HL-60细胞端粒酶h TERT蛋白的表达,且两者具有协同作用。(图8,表15)4.3经DAC(50μmol/L)预处理后,不同药物浓度的AS2O3对HL-60细胞作用48h后,增加药物浓度,端粒酶的h TERT的蛋白相对表达量由0.311±0.015下降到0.055±0.011,较AS2O3单药组蛋白相对表达量显著下降,各药物处理组间及各处理组与AS2O3单药组间比较差异具有统计学意义(P=0.00)。说明DAC预处理可以提升AS2O3对HL-60细胞端粒酶h TERT蛋白的抑制作用。(图9,表16)结论:1不同浓度地西他滨和三氧化二砷及两药联合作用HL-60细胞株后,均有抑制增殖、诱导凋亡的作用,并呈剂量-时间依赖性。2地西他滨和三氧化二砷发挥作用具有协同效应。3经地西他滨预处理后,可以增加三氧化二砷对HL-60细胞株的敏感性,其作用机制可能与降低端粒酶h TERT的表达有关,端粒酶h TERT可能是DAC诱导HL-60细胞凋亡的调控基因之一。