柘蚕沙与柘木化学成分、家蚕肠道芽孢杆菌解毒代谢的研究

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天然的异戊烯化黄酮类化合物,其结构多样,生物活性显著,在多科药用植物中均有分布,具有较高的研究价值;而异戊烯化黄酮苷类成分是一类以异戊烯基取代的黄酮类化合物为苷元的糖苷化产物。尽管已经分离得到大量的异戊烯化黄酮类化合物或黄酮苷类成分,但天然存在的异戊烯化黄酮苷类成分发现较少,主要从植物中分离获得或通过微生物转化得到;此外,异戊烯化的黄酮化合物被糖苷化后,原苷元的化学性质和生物学活性发生改变;因此,异戊烯化黄酮类化合物及其苷类成分的化学结构和生物学活性研究具有重要意义。本文第二章,通过常规柱层析和高效液相色谱法(HPLC)对柘蚕沙中化学成分进行系统分离纯化,并利用核磁波谱(NMR spectra)以及其他手段(紫外UV、红外IR、比旋光度Specific Rotation、电子圆二色谱ECD和高分辨质谱HRESIMS)共鉴定了 35个化合物,包括23个异戊烯化异黄酮葡萄糖苷,其中含21个新化合物,Silexcrin A-U(1-21);10个异戊烯化异黄酮和2个黄酮醇葡萄糖苷。从柘蚕沙中分离得到的异戊烯化异黄酮葡萄糖苷主要在7、3’或4’位羟基上连接上1~2个葡萄糖。通过计算ECD鉴定了两对差向异构体,Silexcrin M-N(13-14)、Silexcrin O-P(15-16)。两对差向异构体的苷元部分均为含有一个手性中心的对映异构体,而当在C环的3’-OH处引入一个葡萄糖时,它们就变成了两对差向异构体,化学性质随之发生改变,这说明糖基化也是实现对映体分离的一种有效方式。此外,因自然界中天然存在的异戊烯化异黄酮苷类成分较少,因此,以柘叶为食的家蚕所产生的粪便排泄物——柘蚕沙,是获得异戊烯化异黄酮苷的天然来源。本文第三章中,我们通过液相HPLC分析结果,发现柘蚕沙与柘叶成分的主要差异是异戊烯化的异黄酮苷。我们以蚕沙中主成分Silexcrin A-E(1-5)和对应苷元6,8-diprenylorobol(24)进行后续研究。利用LC-MS定量分析,进一步证明异戊烯化异黄酮苷并不存在于柘叶中,而是由家蚕肠道代谢产生。据文献报道,芽孢杆菌为家蚕肠内一类具有糖基转移酶(GTs)的肠道优势益生菌,能够实现化合物的糖苷化。我们利用3种芽孢杆菌属细菌对异戊烯化异黄酮,6,8-diprenylorobol(24)进行体外微生物转化,验证了芽孢杆菌属细菌能够将其转化生成相应的糖苷化产物Silexcrin A-E(1-5)。通过大蜡螟的毒性试验,证明了来自柘叶的6,8-diprenylorobol(24)对大蜡螟幼虫具有毒性影响,而其糖苷化产物Silexcrin B(2)的毒性减弱。经MTT法和细胞流式术,我们还发现6,8-diprenylorobol(24)对人脐静脉上皮细胞(HUVEC)也有强的毒性作用,IC50值为1.96μM,能够诱导HUVEC细胞凋亡,阻滞细胞停留在G1期,阻断细胞内DNA的合成以及减少细胞内ROS生成;而其异戊烯化异黄酮苷对HUVEC细胞的毒性大大减弱。揭示了糖苷化是一种重要的解毒方式。此外,我们利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)作为益生菌进行家蚕的益生菌试验。添加B.subtilis后,家蚕体重增加,尤以野三元品系家蚕体重呈显著性增加;依据16S rDNA肠道菌测序分析,家蚕肠道菌群组成发生改变,芽孢杆菌的相对丰度增加;通过HPLC对参与试验家蚕新鲜蚕沙中Silexcrin A-E(1-5)和对应苷元6,8-diprenylorobol(24)相对含量的变化分析,发现添加B.subtilis野三元家蚕的柘蚕沙中5种异戊烯化异黄酮苷总相对含量呈显著性上升,而其苷元6,8-diprenylorobol(24)相对含量显著性下降。由此表明,B.subtilis作为益生菌可以家蚕肠道定植,改善家蚕肠道微环境,改变肠道微生物菌群组成,并促进家蚕生长发育;此外,通过对柘叶中异戊烯化异黄酮类成分的糖苷化,降低毒性成分的含量,增加无毒或减毒的异戊烯化异黄酮苷的含量,通过糖苷化以发挥肠道解毒作用。我们发现肠道芽孢杆菌在家蚕的生长发育中发挥重要作用,为解决家蚕取食柘叶适应性差以及促进生长发育等方面提供思路和依据,为进一步开发蚕用益生菌制剂提供优良策略。此外,在第四章中,我们还对同植物柘树的根,其极性较大的正丁醇萃取部位进行化学成分的研究,从该部分共分离得到18个化合物,包括17个黄酮类化合物和1个Pyroglutamic acid的衍生物;其中,化合物36为黄烷醇类;化合物37-39,为苄基取代的二氢黄酮醇类化合物。
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