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目的:研究磁场结合阿霉素对贴壁生长的肿瘤细胞协同杀伤的细胞学机制,并进一步探究磁场造成细胞周期阻滞的可能原因。
方法:
1.采用MTT法检测磁场、阿霉素及磁场+阿霉素对贴壁生长的肿瘤细胞(SMMC-7721、HepG-2和SW480)增殖的影响。
2.通过光学显微镜、原子力显微镜、单细胞凝胶电泳、流式细胞仪等手段,检测磁场结合阿霉素对肿瘤细胞的协同杀伤效应。
3.采用MTT检测、细胞同步化、免疫荧光法及检测活性氧自由基(ROS)等方法进一步研究磁场及磁场联合阿霉素杀伤肿瘤细胞的机制。
结果:
1.(1)SMMC-7721细胞以1×10<5> cells/mL的细胞密度接种,曝磁6h,即可对细胞生长造成显著的抑制效应(p<0.05);细胞以5×10<4> cells/mL的密度接种,曝磁9h稳恒磁场对其生长有极显著的抑制作用(p<0.01)。(2)HepG-2细胞以1×10<5>cells/mL和5×10<4> cells/mL的细胞密度接种,磁场处理24h,即对细胞增殖有明显的抑制作用(p<0.01)。(3)SW480细胞分别以1×10<5> cells/mL和5×10<4> cells/mL的密度接种,MTT检测发现:磁场分别处理36h和24h即对SW480细胞增殖造成明显的抑制效应(p<0.01)。
2.(1)SMMC-7721细胞以1×10<5> cells/mL的细胞密度接种,40ng/mLN霉素单独处理细胞6h可引起细胞生长抑制(p<0.05);5ng/mL阿霉素与磁场联合作用5h即对细胞有杀伤作用(p<0.05);细胞接种密度为5×10<4> cells/mL时,5ng/mL阿霉素单独处理细胞9h可对细胞生长造成明显的抑制效应(p<0.05),而联合磁场时,作用时间仅用8d,时、阿霉素浓度仅需要0.2ng/mL即对细胞有杀伤作用(p<0.05)。(2)HepG-2细胞以1×10<5> cells/mL的细胞密度接种,10ng/mL阿霉素单独处理细胞12h即可引起细胞生长抑制(p<0.05);联合磁场作用时,细胞生长抑制所需的阿霉素浓度降低到1ng/mL。当细胞以5×10<4> cells/mL的密度接种时,100ng/mL阿霉素单独处理细胞12h可对细胞生长造成明显的抑制效p<0.05,结合磁场共同作用时,阿霉素的浓度只需10ng/mL (p<0.05)。(3)SW480细胞以1×10<5> cells/mL的细胞密度接种,50ng/mL阿霉素单独处理细胞12h即可引起细胞生长抑制 (p<0.05),阿霉素联合磁场作用时的浓度可下降到22.5ng/mL(p<0.05);细胞低密度(5×10<4> cells/mL)生长时,30ng/mL阿霉素单独处理细胞12h可抑制细胞生长p<0.05,联合磁场作用时,阿霉素的浓度可减少到5ng/mL(p<0.05)。
3.(1)HE染色结果及倒置显微镜观察处理前后细胞的形态变化,发现与对照组细胞相比,曝磁组细胞略微鼓起;阿霉素组细胞隆起、回缩,贴壁性能降低;磁场+阿霉素组细胞回缩变圆,细胞边缘粗糙,少量细胞漂浮,视野中可见细胞碎片。(2)原子力显微镜观察细胞表面的微细结构,发现曝磁组细胞表面较为粗糙,表面有向外的隆起,且有数量增多的凹陷存在;细胞经阿霉素处理后,表面破损并出现孔洞结构;当二者联合作用时,细胞表面出现较大较深的不规则孔洞,且孔洞周边隆起,表面破坏严重。(3)磁场、阿霉素以及磁场联合阿霉素处理肿瘤细胞后,细胞周期分布均发生改变;不同组织来源、不同分化程度的肿瘤细胞之间存在差异。SW480和SMMC-7721细胞曝磁后,G2/M期细胞比例增多;而HepG-2细胞经磁场处理后,G1期细胞比例增加。磁场结合阿霉素处理,SMMC-7721细胞G2/M期细胞比例增多,而SW480与HepG-2细胞G1期细胞比例升高。(4)单细胞凝胶电泳检测显示,阿霉素处理可引起细胞DNA损伤,曝磁组细胞未检测到DNA损伤,然而当磁场联合阿霉素作用后,检测到细胞DNA发生严重损伤,与阿霉素组相比存在极显著差异(p<0.01)。
4.(1)当SMMC-7721、HepG-2以及SW480三种肿瘤细胞以不同密度接种,磁场结合不同浓度阿霉素处理不同时间,ROS检测得到一致实验结果:单纯磁场、单纯阿霉素及磁场结合阿霉素作用细胞后,与对照组相比,ROS均有明显增加(p<0.01)。(2)不同周期时相K562细胞,对磁场或/和阿霉素处理的敏感性存在差异,其中对磁场的敏感性排序如下:S期>G2期、M期;对阿霉素的敏感性次序稍有变化:S期>G2期>M期。(3)不同周期时相cyclinB1在细胞中处于不同位置,G1期、S期时位于细胞质;G2期时开始由细胞质转入细胞核;G2/M、M期早期时位于细胞核。经过不同时间曝磁处理后,对照组细胞中cyclin B1定位于细胞质,细胞群体中S期细胞比例较大;实验组中大多数细胞cyclin B1已经转定位于细胞核, G2/M期细胞在整个细胞群体中比例增多。
结论:通过对细胞形态、细胞周期分布及细胞DNA损伤的检测发现:稳恒磁场与阿霉素对肿瘤细胞存在协同杀伤效应。磁场造成细胞周期捕获可能是由于细胞周期蛋白B(cyelin B)在磁场作用下,定位发生变化所致;同时检测到各周期时相对磁场的敏感性存在差异,从而导致了磁场药物联用后某一特定时相细胞数量的增加或下降。