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第一部分SUMO2／3基因的特异性MicroRNA干扰表达载体的构建目的：构建SUMO2/3 (small uniquitin-like modifier 2/3)基因的MicroRNA特异性干扰质粒,为探讨抑制SUMO2／3基因在细胞中表达对B35细胞的影响的研究奠定基础。方法：根据GeneBank数据库提供的SUMO2和SUMO3的DNA序列,首先克隆出SUMO2和SUMO3的功能性基因片段,并将基因片段连接到pcDNA3.1载体；然后分别设计对SUMO2和SUMO3基因特异的miRNA片段,分别命名为miR2和miR3,同时设计一条非特异性序列作为阴性对照,命名为negative-miR,并将这些片段克隆到pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体上。通过转化感受态大肠杆菌,挑选阳性克隆,提取重组质粒,并对抽提的质粒进行限制性酶切反应,DNA测序鉴定。然后将pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR2和pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR3通过酶切和连接反应将miR2和miR3同时连接到同一pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体上,称之为pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR2/3,同时抑制SUMO2和SUMO3的表达。分别将相应的功能基因片段和其对应的抑制性质粒共转染到HT22细胞中,并用50μM H2O2作用转染的细胞10 min,激活SUMO化通路的表达,用Western-Blot在蛋白水平检测SUMO2和SUMO3化蛋白的表达。结果：重组质粒成功转化感受态大肠杆菌,经酶切和电泳证明序列成功插入到pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体预计位点,经DNA测序进一步证明序列完全正确。Western-Blot结果证明pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR2和pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR3分别成功沉默SUMO2和SUMO3基因的表达,并且pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR2/3能够同时沉默SUMO2／3基因的表达。结论：成功构建针对SUMO2／3基因特异性的miRNA真核表达载体,转染细胞后能够明显抑制SUMO2／3基因的表达,为进一步研究其基因功能奠定了基础。第二部分SUMO2／3基因沉默对B35细胞生长的影响和OGD作用后细胞的SUMO化蛋白表达的变化目的：构建稳定转染pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR2/3及pcDNA6.2-GW/EmGFP-negative-miR质粒的B35细胞系,观察SUMO2／3基因沉默对细胞生长的影响,并用OGD体外缺血模型对细胞进行处理,然后根据不同的再灌注时间观察SUMO家族蛋白表达的变化。方法：用携带CMV的pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR2/3质粒和对照质粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-negative-miR转染B35细胞系,用blasticidin筛选出稳定株,用Western-Blot检测SUMO2／3基因表达的改变,然后用CellTiter-Blue reagent试剂盒检测细胞的生长速度。将稳定转染的细胞用体外缺血模型OGD干预后,用Western-Blot检测SUMO家族蛋白表达的变化。结果：稳定转染pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR2/3质粒的B35细胞在受到应激刺激后,SUMO2／3蛋白表达和对照组相比明显降低；并且其细胞生长速度和对照组相比3天后降低为对照组的64%。细胞经过OGD作用后,对照组SUMO1蛋白的表达在0min时降低,然后升高,30min时到达高峰,然后有所降低,但趋势并不是很明显；SUMO2／3沉默组和对照组相比没有明显差别。对照组和正常细胞组SUMO2／3化蛋白表达变化为：在0 min时先降低,然后逐渐升高,30 min达到高峰,然后逐渐降低,至3h后基本恢复正常。和对照组及正常细胞组相比,SUMO2／3沉默组的每个时间段的SUMO2／3化蛋白表达均明显降低,各时间段表达变化不明显。结论：SUMO2／3基因沉默后可以明显降低细胞的生长速度；稳定转染对照载体的细胞和稳定转染pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR2/3质粒载体的细胞经OGD作用后SUMO1蛋白表达没有明显区别；SUMO2／3在稳定转染pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR2／3质粒的B35细胞中表达相对正常细胞组及对照组明显降低,而对照组和正常细胞组相比没有明显区别。第三部分SUMO基因的表达在脊髓缺血性损伤中的改变及机制研究目的：建立小鼠脊髓缺血的简单易重复的动物模型,并检测SUMO蛋白在其中表达的变化。方法：将成年雌性C57B1／6J小鼠用异氟咪麻醉后,取右侧卧位,保持肛温在37.0±0.5℃,于胸8肋间切开1 cm的切口,将一个小动脉瘤夹放置在胸主动脉的胸8部位,根据夹闭时间的不同,将小鼠分为对照组、8 min、10 min和12 min夹闭组,用激光多普勒探头检测夹闭后小鼠腰段脊髓表面血流的变化；同时对各组小鼠在缺血后1h、1d、3d、5d、7d进行BBB评分检查和Rotarod检测；在手术7天后将腰段脊髓取出包埋固定后行HE染色,对脊髓前脚的存活神经元进行计数；同时将另外一批10 min夹闭组和对照组的腰段脊髓组织,用Western-Blot检测脊髓损伤后SUMO蛋白表达的变化。为了研究本模型对小鼠长期存活的影响,我们使另一10 min夹闭组和对照组存活至术后28天,并对其病理生理功能进行检测。结果：在8 min缺血组,BBB评分在1h后下降到15分,24h基本恢复正常,而10 min和12 min组,BBB评分在7天时与对照组和8 min组相比均明显降低,差距具有显著的统计学意义；Rotarod检测结果和BBB评分相似,在7天时,8min组和对照组相比没有明显区别,而10 min或12 min组与对照组或8 min组相比差别有显著统计学意义(p<0.01,10 min or 12 min vs.0 min or 8 min)；胸段脊髓夹闭后可以引起腰段脊髓表面血流降低到夹闭前的10%；神经功能障碍和神经元细胞的死亡和缺血时间密切相关。长时程10min夹闭检测组的小鼠有80%存活到28天,BBB评分和Rotarod检测和对照组相比差异显著的统计学意义(p<0.01)。结论：成功建立了小鼠的脊髓缺血模型,脊髓缺血后SUMO2／3蛋白表达和对照组相比明显升高,这和脑缺血后SUMO化蛋白表达变化相似。