论文部分内容阅读
目的:肝癌是是常见的癌症,全球70%–90%原发性肝癌被诊断为肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)。肝癌的发生发展涉及到多种分子结构、肿瘤癌基因、抑癌基因、基因表达谱和胞内信号通路的改变,但目前对影响其发生发展的精确分子机制及各种改变之间的协同作用尚不完全清楚。因此,研究新的基因功能改变以及影响肝癌发生发展的分子机制,将对HCC患者的早期诊断,预后预测、治疗药物设计提供重要理论基础。衰老标记蛋白-30(Senescence marker protein-30,SMP30)是本课题组一直进行研究的肝癌相关抗原,研究显示SMP30在肝癌诊断中具有重要意义。但是SMP30对肝癌细胞的恶性生物学特征如增殖、侵袭及转移等的影响及其分子机制,目前尚不清楚。本课题旨在阐明增强和抑制SMP30基因表达对肝癌生物学行为影响及其调控的机制。方法:1.收集广西医科大学第一附属医院进行手术治疗的肝癌患者的肝癌组织17例,并同时收集癌旁组织,QPCR检测SMP30的表达水平;WB和QPCR检测SMP30 mRNA和蛋白在SK-hep-1,MHCC97-L,Hep3B三种细胞中的表达;2.将插入有SMP30 CDS的慢病毒以及阴性对照空载慢病毒LV5分别转染肝癌细胞SK-hep-1,流式细胞仪筛选后获得稳定过表达SMP30的细胞模型。QPCR和Western-blot法分别检测转染前后目的基因SMP30在转录水平和翻译水平的表达变化。通过Transwell实验和划痕实验检测细胞的迁移能力的改变,Transwell实验检测侵袭能力的改变;CCK8实验检测转染细胞株与对照组细胞增殖能力的差异;利用芯片检测SK-hep-1-SMP30组和SK-hep-1-NC组中差异mRNAs,生物信息学分析SMP30相关基因的改变,Western-blot验证;3.将插入有靶向抑制SMP30基因的siRNA序列的慢病毒以及空载慢病毒LV3分别转染Hep3B肝癌细胞,流式筛选建立稳定转染的敲低SMP30的细胞模型。QPCR和Westernblot法分别检测转染前后目的基因SMP30在转录水平和翻译水平的表达变化。通过Transwell实验和划痕实验检测转染细胞株与对照组细胞迁移能力的改变,Transwell实验检测转染细胞株与对照组细胞侵袭能力的改变,CCK8实验检测转染细胞株与对照组细胞增殖能力的差异,Western-blot检测wnt/β-catenin途径通路相关基因表达;4.使用Targetscan等软件工具预测可能调控SMP30的microRNA。QPCR检测miR-382 mimic瞬时转染后肝癌细胞中miR-382的表达。QPCR、Western blot(WB)对比转染miR-382前后细胞表达SMP30的区别。构建含有SMP30-3’UTR荧光素酶报告质粒,将miR-382的mimics、mutation与对照组的肝癌细胞中共转染SMP30-3’UTR荧光素酶报告质粒,检测荧光素酶活性,确定miR-382对SMP30-3’UTR的调节关系。QPCR检测在肝癌组织和不同细胞中miR-382表达情况。Transwell法检测转染miR-382 mimic前后细胞侵袭与迁移能力的区别。结果:1.SMP30在肝癌临床样本中表达低于癌旁组织(P<0.01),SMP30在不同肝癌细胞中表达情况不同,在SK-hep-1中SMP30 mRNA和蛋白均最低;2.SK-hep-1-SMP30和SK-hep-1-NC细胞流式筛选后细胞100%带有绿色荧光,成功构建了稳定表达SMP30的慢病毒细胞株,QPCR、Westernblot法显示SK-hep-1-SMP30细胞中SMP30 mRNA和蛋白质水平上表达均较SK-hep-1-NC细胞组高(P<0.01)。SK-hep-1-SMP30组和SK-hep-1-NC组相比较,对肝癌细胞增殖无统计学差异(P>0.05),但过表达SMP30抑制细胞的侵袭与迁移(P<0.01)。芯片检测、生物信息学预测、Western-blot验证表明SMP30可能通过EMT和Wnt/β-catenin途径抑制肝癌细胞的侵袭与迁移(P<0.05)。3.Hep3B-siRNA和Hep3B-NC细胞流式筛选后细胞100%带有绿色荧光,成功构建了稳定敲低SMP30的慢病毒细胞株,QPCR、Western-blot法显示四种Hep3B-siRNA中以Hep3B-siRNA-939抑制效果作用明显(P<0.01),选用Hep3B-siRNA-939进行后续行为学实验。Hep3BsiRNA-939组和Hep3B-siRNA-NC组相比较,对肝癌细胞增殖无统计学差异(P>0.05),但敲低SMP30促进细胞的侵袭与迁移(P<0.01)。Western-blot验证表明SMP30可能通过EMT和wnt/β-catenin途径促进肝癌细胞的侵袭与迁移(P<0.05);4.我们综合运用TargetScan,miRanda等在线检测结合既往的研究结果,分析显示miR-382可能是潜在调控SMP30microRNA。瞬时转染miR-382 mimic后,miR-382 mimic组相对于miR-382negative control组中的miR-382的相对表达量增高了21.06963倍(p<0.01)。SMP30 mRNA、蛋白水平的表达在miR-382 mimics的肝癌细胞中均下降(p<0.01)。荧光素酶检测表明,与对照组相比,miR-382 mimic\SMP30-3’UTR共转染细胞荧光强度表达显著下降(P<0.05),而miR-382-mut组中荧光强度表达无明显变化。QPCR结果显示在8例肝癌患者中,肝癌组织miR-382的表达水平为显著高于癌旁正常组织。在不同细胞中miR-382表达情况不同,肝癌细胞中SK-hep-1的细胞内的miR-382表达最高。miR-382 mimic瞬时转染后促进肝癌细胞MHCC97-L的侵袭与转移能力(P<0.01)。Western-blot验证表明miR-382可能通过靶向抑制SMP30的表达,进而通过EMT和Wnt/β-catenin途径抑制细胞的侵袭与迁移。结论:1.SMP30在肝癌临床样本中表达低于癌旁组织表明SMP30具有一定的临床意义;根据SMP30在不同肝癌细胞中表达情况不同,可选取SKhep-1细胞作为过表达SMP30实验对象,MHCC97-L,Hep3B作为抑制SMP30实验对象;2.成功构建了稳定过表达SK-hep-1-SMP30和SK-hep-1-NC细胞株。SMP30过表达抑制肝癌SK-hep-1细胞迁移,侵袭能力。SMP30可能通过EMT和Wnt/β-catenin途径抑制细胞的侵袭与迁移;3.成功构建了Hep3B-siRNA和Hep3B-NC细胞株。SMP30敲低促进肝癌Hep3B细胞迁移,侵袭能力。抑制SMP30表达后,可能通过EMT和wnt/β-catenin途径促进细胞的侵袭与迁移;4.miR-382是调控SMP30基因的microRNA之一。miR-382能下调SMP30的表达。miR-382的表达在组织、细胞中与SMP30呈负相关性。miR-382促进肝癌细胞的侵袭与转移。miR-382可能通过靶向抑制SMP30的表达,进而通过EMT和Wnt/β-catenin途径抑制细胞的侵袭与迁移。