论文部分内容阅读
大戟科大戟属有毒中药京大戟、狼毒、甘遂均属于峻下逐水药,临床用于治疗水肿、腹水、大便不通等,但生品药性猛烈,使用不当均会引起强烈的腹痛、腹泻等毒性作用,故而在使用前均需进行炮制。《中国药典》2015版载京大戟、甘遂、狼毒的炮制方法均采用醋制法(醋炙、醋煮)。采用醋制其目的是降低毒性,缓和峻下作用。
京大戟、狼毒、甘遂同属大戟科大戟属,均具有导致腹痛腹泻的毒副作用。课题组前期的文献研究发现,三种有毒中药均具有二萜类成分,有研究表明大戟科有毒中药的二萜类成分可能与其毒性相关。基于植物化学分类学理论,这三种有毒中药同属于同一科属,其毒性与化学成分之间必然存在某种相关性;并且这三种有毒中药均采用醋制法作为共性的炮制技术,可能存在共性的减毒机制。
根据以上假设,本论文以大戟科三种有毒中药京大戟、狼毒、甘遂为研究对象,通过追踪、富集、分离三种有毒中药的共性毒性部位和毒性成分,在整体动物、细胞分子水平评价三种有毒中药醋制前后的毒性变化,同时通过醋制后毒性成分的变化及新生成化合物的结构解析,分析醋制前后毒性变化与成分变化的相关性,系统研究并阐释这三种同科属有毒中药醋制减毒的共性规律。主要研究工作如下。
1.大戟科三种有毒中药毒性部位的筛选及毒性成分研究
筛选京大戟、狼毒、甘遂三者的共性毒性部位:提取得到三种有毒中药95%乙醇部位并萃取得到石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯3个极性部位,小鼠灌胃给药,测定粪便含水量、肠道含水量,采用实时荧光定量QPCR(实时定量PCR)法测定结肠中炎症因子表达水平,采用巨噬细胞培养模型测定炎症因子释放,分别从整体动物、细胞及分子多水平评价各极性部位的毒性,筛选三种有毒中药的毒性部位。结果表明除二氯甲烷部位外,京大戟、狼毒和甘遂的95%醇提取物及石油醚、乙酸乙酯部位均可导致小鼠粪便含水量及结肠含水量的增加,均能够显著升高小鼠结肠中炎症因子iNOS(一氧化氮合成酶)、IL-1(白细胞介素1β)、TNF-α(肿瘤坏死因子α)的mRNA表达水平(P<O.05),表明这三种有毒中药均可导致肠道炎症的产生及肠道水肿的发生,可导致腹痛、腹泻,具有显著的肠道毒性,其毒性表现与临床毒性反应一致。且这三种有毒中药的不同极性部位中,均以石油醚部位的毒性作用最强。三者导致的胃肠道毒性作用与干扰肠道水液代谢平衡及引起肠道炎症密切相关。
论文进一步选择三种有毒中药的石油醚部位进行分离纯化。采用硅胶柱层析法,以石油醚-乙酸乙酯作为洗脱剂,得到不同极性的洗脱部位,继而采用薄层制各、Sephadex LH-20凝胶柱层析及制备液相法进行纯化,获得15种单体化合物。从三种有毒中药毒性部位中分离获得的化合物主要为二萜类成分,其中二萜Pekinenin G为分离获得的新化合物。以分离获得的化合物刺激胃肠道细胞BGC823、IEC-6、HT-29,采用MTT法评价各化合物的毒性大小;并以刺激巨噬细胞释放炎症因子为模型,比较不同化合物的毒性差异,研究表明这三种有毒中药中分离得到的二萜类成分能够显著抑制BGC823、IEC-6、HT-29细胞的增殖并诱导炎症的发生;论文进一步研究了这三种有毒中药中分离获得的不同构型二萜类成分对HT-29细胞AQP3表达的干扰作用,结合MTT及巨噬细胞毒性评价模型,发现不同构型二萜类化合物的毒性作用有较大差异,以巴豆烷型的Pros仃atin及西松烷型的Pekinenin G毒性最强。实验结果为后期大戟科3种有毒中药成分变化及毒性机制研究提供了依据。
2.大戟科三种有毒中药二萜类毒性部位富集及毒性机制初步研究
论文依据所分离获得的毒性化合物的性质,以京大戟为代表,进一步考察不同溶剂的富集效率,最终选择以氯仿为提取溶剂索氏提取。对三种有毒中药氯仿提取部位进行液相及质谱分析,研究其中二萜类成分与前期部位筛选中所获得的石油醚部位的差异,发现氯仿提取部位富集的毒性二萜类成分含量较高。进一步考察氯仿提取部位的毒性,发现三种有毒中药氯仿部位的毒性远大于非氯仿部位。研究结果表明大戟科有毒中药的毒性物质基础可能为其二萜类成分,该类成分可为氯仿所提取及富集。
大戟科三种有毒中药的毒性与肠道炎症刺激性及干扰肠道水液代谢平衡密切相关。文献研究表明,炎症的发生与肠道水液转运密切相关。本文建立了巨噬细胞RAW264.7(Macrophage cells,小鼠腹腔巨噬细胞)及结肠上皮细胞HT-29的共培养模型,以模拟机体中巨噬细胞与肠道上皮细胞两种细胞共存的状态。并以此模型进一步评价炎症因子与水通道蛋白表达的关系及化合物的毒性大小,研究三种有毒中药醋制后成分变化与毒性变化的相关性。通过同一化合物在共培养体系与非共培养体系中的对比发现,共培养体系中毒性二萜类成分能够加快并提高HT-29细胞中AQP3的表达,且蛋白在3小时即达到峰值,此结果与整体实验结果一致,说明建立的该评价体系客观、可信。通过比较京大戟及狼毒中代表性二萜单体化合物、二萜单体混合物及各自氯仿部位三者的毒性大小,研究表明二萜单体的混合物毒性远强于单体二萜及氯仿部位,这一研究结果进一步佐证了二萜类成分确实是三种有毒中药的毒性成分,同时也进一步表明肠道炎症能加速肠道水液代谢紊乱。
3.大戟科三种有毒中药醋制解毒共性机制研究
论文前述研究结果显示以氯仿为提取溶剂采用索氏提取的方法能够较好的富集大戟科三种根类有毒中药中的主要毒性成分——二萜类成分,故进一步以三者的氯仿提取部位作为研究对象研究其醋制解毒机理。依法炮制并提取获得三种有毒中药的生品及醋制品氯仿部位,灌胃ICR小鼠,测定小鼠粪便含水量及小鼠肠道含水量,结肠中炎症因子NO、IL-1及TNF-α的mRNA表达水平量,结肠AQPs(Aquaporins,水通道蛋白)蛋白表达量,评价京大戟、狼毒、甘遂这三种有毒中药醋制前后的毒性变化。研究发现三种有毒中药醋制后,氯仿提取部位引起的小鼠粪便含水量及结肠含水量显著下降,结肠中炎症因子NO、IL-1及TNF-α的mI斟A表达显著下降,结肠AQP3、AQP4蛋白表达显著下降,AQP1蛋白表达显著上升。表明醋制确可降低三种有毒中药对结肠的致炎作用,缓和三种有毒中药对结肠中AQPs表达的干扰作用,降低肠道水肿反应程度,缓和腹痛、腹泻毒性反应。
以分离得到的单体作为对照,采用HPLC(高效液相色谱法)法分析京大戟及狼毒醋制前后成分变化,研究发现,京大戟及狼毒中C-11、C-12位具有环氧环结构的西松烷型二萜Pekinenin G及C-18位具有醛基的Pekinellin C经过醋制后含量下降,而C-11、C-12位为双键结构的Pekinenin A及C-18位具有羧基的YuexiandajisuA则在炮制后含量上升;另一种具有较强毒性的二萜类成分——巴豆烷型二萜Prostratin,醋制后在狼毒中的含量也显著下降;通过LC-MS/MS(高效液相色谱串联二级质谱)法,以响应强度作为半定量依据,发现甘遂中的Prostratin及其他巴豆烷型、巨大戟烷型二萜类成分经过醋制后均有不同程度的含量下降。进一步采用模拟醋制方法,将分离得到的单体Prostratin及西松烷型二萜类成分混合物进行醋制,得到二萜类化合物模拟醋制后的产物,采用LC-MS/MS,分析模拟醋制后二萜类成分变化规律,发现该类型成分经过醋制后,结构中的一些特殊官能基团发生明显变化,如西松烷型中的环氧环结构在炮制过程中发生了开环反应,并发生分子重排,醛基氧化为羧基;而巴豆烷型二萜具有的酯型结构侧链在醋制过程中发生水解,同时大环上的羟基发生消去反应而生成双键。此外,运用共培养模型对醋制前后化学成分进行毒性评价,发现醋制后成分含量下降的Pekinenin G、Pekinenin C的毒性远大于含量上升的Pekinenin A、YuexiandajisuA,且通过对Prostratin模拟醋制前后毒性大小的评价,发现Prostratin醋制后的毒性大大降低,说明三种有毒中药经过醋制,毒性大的二萜类成分转化为毒性小的二萜类成分,从而达到降低毒性缓和药性的炮制目的。
本论文通过对三种有毒中药的体内体外实验,筛选出毒性部位,并分离得到毒性二萜类成分,共分离得到包括一个新化合物在内8种二萜类成分,该类成分能够诱导巨噬细胞释放炎症因子,提高结肠细胞中AQP3的表达,且不同的二萜类成分的毒性作用差异明显。故二萜类成分是其导致腹痛、腹泻的化学物质基础。进一步研究发现炎症的发生可加速干扰肠道水通道蛋白的表达变化,即炎症与肠道水液代谢障碍相关。且三种有毒中药中均存在共性的二萜类成分。醋制能够使得三种有毒中药中的二萜类成分结构遭到破坏,巴豆烷型二萜的酯键侧链水解,环上的羟基发生消去反应;西松烷型二萜环氧环开环重排,醛基氧化为羧基;使得高毒性的二萜类成分转化为低毒性的二萜类成分,毒性成分所引起的腹泻、炎症和水液代谢紊乱的毒性作用显著降低。
本论文证实了大戟科同科同属有毒中药采用醋制解毒的科学性和合理性,初步阐明了其醋制解毒的共性毒性成分(部位)及醋制解毒的共性机制,同时为大戟科三种有毒中药质量控制和工艺提供了理论及实践依据。
通过对大戟属有毒中药炮制解毒的研究,本论文提出“同科属有毒中药能够采用相同的炮制技术解毒其解毒机制存在共性”的理论,为其他科属有毒中药炮制解毒研究提供借鉴。
京大戟、狼毒、甘遂同属大戟科大戟属,均具有导致腹痛腹泻的毒副作用。课题组前期的文献研究发现,三种有毒中药均具有二萜类成分,有研究表明大戟科有毒中药的二萜类成分可能与其毒性相关。基于植物化学分类学理论,这三种有毒中药同属于同一科属,其毒性与化学成分之间必然存在某种相关性;并且这三种有毒中药均采用醋制法作为共性的炮制技术,可能存在共性的减毒机制。
根据以上假设,本论文以大戟科三种有毒中药京大戟、狼毒、甘遂为研究对象,通过追踪、富集、分离三种有毒中药的共性毒性部位和毒性成分,在整体动物、细胞分子水平评价三种有毒中药醋制前后的毒性变化,同时通过醋制后毒性成分的变化及新生成化合物的结构解析,分析醋制前后毒性变化与成分变化的相关性,系统研究并阐释这三种同科属有毒中药醋制减毒的共性规律。主要研究工作如下。
1.大戟科三种有毒中药毒性部位的筛选及毒性成分研究
筛选京大戟、狼毒、甘遂三者的共性毒性部位:提取得到三种有毒中药95%乙醇部位并萃取得到石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯3个极性部位,小鼠灌胃给药,测定粪便含水量、肠道含水量,采用实时荧光定量QPCR(实时定量PCR)法测定结肠中炎症因子表达水平,采用巨噬细胞培养模型测定炎症因子释放,分别从整体动物、细胞及分子多水平评价各极性部位的毒性,筛选三种有毒中药的毒性部位。结果表明除二氯甲烷部位外,京大戟、狼毒和甘遂的95%醇提取物及石油醚、乙酸乙酯部位均可导致小鼠粪便含水量及结肠含水量的增加,均能够显著升高小鼠结肠中炎症因子iNOS(一氧化氮合成酶)、IL-1(白细胞介素1β)、TNF-α(肿瘤坏死因子α)的mRNA表达水平(P<O.05),表明这三种有毒中药均可导致肠道炎症的产生及肠道水肿的发生,可导致腹痛、腹泻,具有显著的肠道毒性,其毒性表现与临床毒性反应一致。且这三种有毒中药的不同极性部位中,均以石油醚部位的毒性作用最强。三者导致的胃肠道毒性作用与干扰肠道水液代谢平衡及引起肠道炎症密切相关。
论文进一步选择三种有毒中药的石油醚部位进行分离纯化。采用硅胶柱层析法,以石油醚-乙酸乙酯作为洗脱剂,得到不同极性的洗脱部位,继而采用薄层制各、Sephadex LH-20凝胶柱层析及制备液相法进行纯化,获得15种单体化合物。从三种有毒中药毒性部位中分离获得的化合物主要为二萜类成分,其中二萜Pekinenin G为分离获得的新化合物。以分离获得的化合物刺激胃肠道细胞BGC823、IEC-6、HT-29,采用MTT法评价各化合物的毒性大小;并以刺激巨噬细胞释放炎症因子为模型,比较不同化合物的毒性差异,研究表明这三种有毒中药中分离得到的二萜类成分能够显著抑制BGC823、IEC-6、HT-29细胞的增殖并诱导炎症的发生;论文进一步研究了这三种有毒中药中分离获得的不同构型二萜类成分对HT-29细胞AQP3表达的干扰作用,结合MTT及巨噬细胞毒性评价模型,发现不同构型二萜类化合物的毒性作用有较大差异,以巴豆烷型的Pros仃atin及西松烷型的Pekinenin G毒性最强。实验结果为后期大戟科3种有毒中药成分变化及毒性机制研究提供了依据。
2.大戟科三种有毒中药二萜类毒性部位富集及毒性机制初步研究
论文依据所分离获得的毒性化合物的性质,以京大戟为代表,进一步考察不同溶剂的富集效率,最终选择以氯仿为提取溶剂索氏提取。对三种有毒中药氯仿提取部位进行液相及质谱分析,研究其中二萜类成分与前期部位筛选中所获得的石油醚部位的差异,发现氯仿提取部位富集的毒性二萜类成分含量较高。进一步考察氯仿提取部位的毒性,发现三种有毒中药氯仿部位的毒性远大于非氯仿部位。研究结果表明大戟科有毒中药的毒性物质基础可能为其二萜类成分,该类成分可为氯仿所提取及富集。
大戟科三种有毒中药的毒性与肠道炎症刺激性及干扰肠道水液代谢平衡密切相关。文献研究表明,炎症的发生与肠道水液转运密切相关。本文建立了巨噬细胞RAW264.7(Macrophage cells,小鼠腹腔巨噬细胞)及结肠上皮细胞HT-29的共培养模型,以模拟机体中巨噬细胞与肠道上皮细胞两种细胞共存的状态。并以此模型进一步评价炎症因子与水通道蛋白表达的关系及化合物的毒性大小,研究三种有毒中药醋制后成分变化与毒性变化的相关性。通过同一化合物在共培养体系与非共培养体系中的对比发现,共培养体系中毒性二萜类成分能够加快并提高HT-29细胞中AQP3的表达,且蛋白在3小时即达到峰值,此结果与整体实验结果一致,说明建立的该评价体系客观、可信。通过比较京大戟及狼毒中代表性二萜单体化合物、二萜单体混合物及各自氯仿部位三者的毒性大小,研究表明二萜单体的混合物毒性远强于单体二萜及氯仿部位,这一研究结果进一步佐证了二萜类成分确实是三种有毒中药的毒性成分,同时也进一步表明肠道炎症能加速肠道水液代谢紊乱。
3.大戟科三种有毒中药醋制解毒共性机制研究
论文前述研究结果显示以氯仿为提取溶剂采用索氏提取的方法能够较好的富集大戟科三种根类有毒中药中的主要毒性成分——二萜类成分,故进一步以三者的氯仿提取部位作为研究对象研究其醋制解毒机理。依法炮制并提取获得三种有毒中药的生品及醋制品氯仿部位,灌胃ICR小鼠,测定小鼠粪便含水量及小鼠肠道含水量,结肠中炎症因子NO、IL-1及TNF-α的mRNA表达水平量,结肠AQPs(Aquaporins,水通道蛋白)蛋白表达量,评价京大戟、狼毒、甘遂这三种有毒中药醋制前后的毒性变化。研究发现三种有毒中药醋制后,氯仿提取部位引起的小鼠粪便含水量及结肠含水量显著下降,结肠中炎症因子NO、IL-1及TNF-α的mI斟A表达显著下降,结肠AQP3、AQP4蛋白表达显著下降,AQP1蛋白表达显著上升。表明醋制确可降低三种有毒中药对结肠的致炎作用,缓和三种有毒中药对结肠中AQPs表达的干扰作用,降低肠道水肿反应程度,缓和腹痛、腹泻毒性反应。
以分离得到的单体作为对照,采用HPLC(高效液相色谱法)法分析京大戟及狼毒醋制前后成分变化,研究发现,京大戟及狼毒中C-11、C-12位具有环氧环结构的西松烷型二萜Pekinenin G及C-18位具有醛基的Pekinellin C经过醋制后含量下降,而C-11、C-12位为双键结构的Pekinenin A及C-18位具有羧基的YuexiandajisuA则在炮制后含量上升;另一种具有较强毒性的二萜类成分——巴豆烷型二萜Prostratin,醋制后在狼毒中的含量也显著下降;通过LC-MS/MS(高效液相色谱串联二级质谱)法,以响应强度作为半定量依据,发现甘遂中的Prostratin及其他巴豆烷型、巨大戟烷型二萜类成分经过醋制后均有不同程度的含量下降。进一步采用模拟醋制方法,将分离得到的单体Prostratin及西松烷型二萜类成分混合物进行醋制,得到二萜类化合物模拟醋制后的产物,采用LC-MS/MS,分析模拟醋制后二萜类成分变化规律,发现该类型成分经过醋制后,结构中的一些特殊官能基团发生明显变化,如西松烷型中的环氧环结构在炮制过程中发生了开环反应,并发生分子重排,醛基氧化为羧基;而巴豆烷型二萜具有的酯型结构侧链在醋制过程中发生水解,同时大环上的羟基发生消去反应而生成双键。此外,运用共培养模型对醋制前后化学成分进行毒性评价,发现醋制后成分含量下降的Pekinenin G、Pekinenin C的毒性远大于含量上升的Pekinenin A、YuexiandajisuA,且通过对Prostratin模拟醋制前后毒性大小的评价,发现Prostratin醋制后的毒性大大降低,说明三种有毒中药经过醋制,毒性大的二萜类成分转化为毒性小的二萜类成分,从而达到降低毒性缓和药性的炮制目的。
本论文通过对三种有毒中药的体内体外实验,筛选出毒性部位,并分离得到毒性二萜类成分,共分离得到包括一个新化合物在内8种二萜类成分,该类成分能够诱导巨噬细胞释放炎症因子,提高结肠细胞中AQP3的表达,且不同的二萜类成分的毒性作用差异明显。故二萜类成分是其导致腹痛、腹泻的化学物质基础。进一步研究发现炎症的发生可加速干扰肠道水通道蛋白的表达变化,即炎症与肠道水液代谢障碍相关。且三种有毒中药中均存在共性的二萜类成分。醋制能够使得三种有毒中药中的二萜类成分结构遭到破坏,巴豆烷型二萜的酯键侧链水解,环上的羟基发生消去反应;西松烷型二萜环氧环开环重排,醛基氧化为羧基;使得高毒性的二萜类成分转化为低毒性的二萜类成分,毒性成分所引起的腹泻、炎症和水液代谢紊乱的毒性作用显著降低。
本论文证实了大戟科同科同属有毒中药采用醋制解毒的科学性和合理性,初步阐明了其醋制解毒的共性毒性成分(部位)及醋制解毒的共性机制,同时为大戟科三种有毒中药质量控制和工艺提供了理论及实践依据。
通过对大戟属有毒中药炮制解毒的研究,本论文提出“同科属有毒中药能够采用相同的炮制技术解毒其解毒机制存在共性”的理论,为其他科属有毒中药炮制解毒研究提供借鉴。