玻璃化是植物组织培养过程中特有的一种生理失调或生理病变,普遍发生于多种植物中。玻璃化试管苗呈透明或半透明的水浸状,叶片卷曲畸形,分化及存活能力低,无法进行继代培养及驯化移栽,给种苗商业化生产造成了严重的经济损失,也限制了组织培养技术在种质资源保存及基因工程育种中的应用。目前,对玻璃化发生的机制尚没有统一的认识,系统研究玻璃化发生发展的机制并开发有效的防控措施对于组织培养技术的良性发展具有重要的理论及实践意义。本论文以石竹和拟南芥为对象,分析了玻璃化苗显微结构及生理生化特征,并构建了拟南芥玻璃化苗基因组甲基化数据库及转录组数据库,与正常苗进行了差异比较,同时系统研究了乙烯在玻璃化发生中的作用机制及AgNO3防控玻璃化的效应。主要结果如下:(1)利用扫描电镜和透射电镜对正常苗和玻璃化苗组织及细胞结构进行了观察,发现玻璃化苗茎、叶显微和亚显微结构发生明显改变。玻璃化苗细胞壁变薄,膜结构受损,细胞质稀薄,叶绿体及淀粉粒数量减少;导管管腔出现塌陷、堵塞;气孔在脱落酸、黑暗及脱水处理下均不能正常关闭。(2)对玻璃化苗和正常苗水分及活性氧代谢相关指标进行了检测,结果表明,与正常苗相比,玻璃化苗自由水含量增加了 21%,束缚水含量降低了 18%,质外体水含量增加了 6.5倍,质外体气体含量降低了 89%;过氧化氢(H202)含量及氧阴离子自由基(O2·-)产生速率分别提高了 2.2倍和3.1倍,多种抗氧化酶活性及抗氧化物质含量显著降低;丙二醛(MDA)含量及相对电导率分别增加了 1.5倍及2.6倍。表明玻璃化苗水分及活性氧代谢异常,氧化平衡破坏,水分过度积累。(3)利用全基因组甲基化测序技术构建了拟南芥玻璃化苗及正常苗的基因组甲基化数据库,分析了玻璃化苗基因组甲基化特点及与正常苗基因组甲基化的差异。玻璃化苗基因组CHH甲基化水平明显低于正常苗。共鉴定出4066个DNA甲基化水平发生变化的差异甲基化区域(Differentially Methylated Regions,DMRs),其中包括1016个高甲基化DMRs和3050个低甲基化DMRs;CHH序列中的DMRs数量显著高于CG和CHG序列中的DMRs数量;GO分析表明,CHH差异甲基化基因/启动子主要富集于胁迫响应、刺激(应激、化学物质和激素)响应和细胞代谢途径。表明CHH区域低甲基化引起的胁迫或刺激响应及代谢的改变是玻璃化的主要原因。(4)构建了拟南芥玻璃化苗的转录组数据库,并与正常苗转录组进行了比较,共筛选到2197个差异表达基因,其中上调表达基因1212个,下调表达基因985个。Mapman分析发现,差异表达基因富集于乙烯、活性氧信号通路及细胞壁通路,并且多数呈上调表达。甲基化组和转录组联合分析结果表明,CHH甲基化水平与基因表达水平呈负相关。表明CHH低甲基化介导的乙烯和活性氧信号通路相关基因高表达可能是玻璃化发生发展的主要原因。(5)在玻璃化诱导条件下,野生型拟南芥和脱落酸不敏感突变体均出现典型的玻璃化症状,而乙烯不敏感突变体和用乙烯作用抑制剂AgN03培养的野生型均不发生玻璃化,说明乙烯是诱导玻璃化发生的关键因子。亚硫酸氢盐测序分析结果表明,玻璃化苗乙烯合成酶基因ACSJ和乙烯受体基因ETR1启动子甲基化水平明显低于正常苗,ACS1和ETR1基因表达量显著高于正常苗,而培养基中添加AgNO3可提高ACS1和和ETR1基因启动子DNA甲基化水平,降低基因表达。同时,玻璃化苗内源乙烯含量增加,气孔开度减小,失水速率下降,水孔蛋白磷酸化水平升高,吸水能力增强,而AgN03可降低玻璃化苗内源乙烯含量,增大气孔开度,提高失水速率,降低水孔蛋白磷酸化水平及吸水能力。表明,不适的组织培养条件可使乙烯合成及信号转导相关基因低甲基化,从而介导基因表达量增加,乙烯合成及信号转导增强,引起细胞失水减少、吸水增强,导致组织水分过度积累,玻璃化症状产生,而AgNO3可通过提高乙烯合成及信号转导相关基因甲基化水平抑制这一过程。(6)培养基中添加30 μmol/L AgNO3可使67%的石竹玻璃化苗恢复正常,并可使石竹玻璃化率从63.3%降低到2.67%。生理生化检测结果表明,AgNO3可降低石竹试管苗乙烯合成及乙烯信号转导相关基因的表达,降低内源性乙烯含量,增强抗氧化酶活性,减少保卫细胞中H2O2水平,增加叶片气孔开度和失水率,降低组织含水量。综上所述,本研究阐明了 DNA低甲基化介导的乙烯信号通路基因活化导致拟南芥玻璃化发生的机制及AgN03抑制拟南芥玻璃化的作用与机制,同时用石竹验证了AgN03控制玻璃化的作用,为全面揭示试管苗玻璃化发生机制及玻璃化的有效防治提供了重要的参考及指导。