背景和目的增殖诱导配体(a proliferation-inducing ligand, APRIL)分子于1998年被发现和克隆,它是肿瘤坏死因子(TNF)超家族的一个新成员,在正常组织的表达较弱,但在多种肿瘤细胞系和肿瘤组织中(特别是消化道肿瘤)有高水平表达。APRIL密切参与了促进多种肿瘤细胞增殖、延长肿瘤细胞存活及加速肿瘤形成等过程,因此,设法有效抑制APRIL的功能活性,将为相关肿瘤的治疗提供新途径。人APRIL属Ⅱ型跨膜蛋白,全长为250个氨基酸,其中29-49氨基酸为疏水的跨膜区,50-250氨基酸为胞外区,经furin转换酶在富含精氨酸的基序R-K-R-R处(101-104氨基酸残基处)裂解后,部分胞外区从膜上脱下,形成天然sAPRIL(即105-250氨基酸区域),sAPRIL与全长(即膜结合型)APRIL的生物学活性基本一致,并具有可溶性,是APRIL发挥功能的主要区域。噬菌体展示是一项选择技术,利用生物分子间的相互作用来筛选功能分子,它在研究蛋白质间相互作用、筛选受体的激动剂和拮抗剂、新药和疫苗的研发以及在抗肿瘤药物研究中都有重要价值。噬菌体展示技术将外源多肽或蛋白与噬菌体的一种衣壳蛋白融合表达,融合蛋白将展示在病毒颗粒的表面,而编码这个融合子的DNA则位于该病毒粒子内。使大量随机多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系,使得各种靶分子(抗体、酶、细胞表面受体等)的多肽配体通过一种被称为淘选(panning)的体外选择程序得以快速鉴定。随着筛选靶标范围的拓展,噬菌体展示技术进一步在肿瘤靶向治疗、功能基因组学及筛选新配体等方面得到大量应用。本课题采用噬菌体展示技术,通过随机十二肽噬菌体展示文库筛选出与重组人可溶性APRIL (soluble APRIL, sAPRIL)蛋白结合的噬菌体呈现型多肽,进一步筛选出其中对sAPRIL促进相关大肠癌细胞增殖效应有明显抑制作用的多肽序列,然后人工合成相应sAPRIL结合肽进行大肠癌增殖抑制实验,分别在体外以及裸鼠移植瘤模型上进行验证。以揭示APRIL作用的靶位点,为APRIL高表达肿瘤治疗探索新的技术途径。材料与方法1.主要材料表达纯化的重组人sAPRIL蛋白,抗APRIL单克隆抗体,LOVO、SW620、HT-29、SW480及HCT116大肠癌细胞株,噬菌体展示十二肽试剂盒,HRP标记的抗M13抗体,HRP标记的兔抗鼠IgG, SPF级BALB/c裸小鼠。2.主要方法2.1噬菌体展示技术筛选sAPRIL结合肽采用直接亲和富集法,以表达纯化的sAPRIL蛋白为靶分子,对噬菌体十二肽库进行4轮亲和淘洗,具体方法：将噬菌体展示十二肽库与包被有sAPRIL蛋白的酶标板共温育,先洗去未结合噬菌体,然后洗脱特异性结合的噬菌体。将被洗脱的噬菌体进行扩增,然后再进行下一轮的结合／扩增循环,以富集那些可结合序列。经4轮淘选后,获得与sAPRIL结合的噬菌体单克隆。ELISA检测挑选出亲和力强的阳性克隆,通过DNA测序对每个可结合克隆进行定性,根据噬菌体克隆基因中所插入的外源DNA序列推导出呈现sAPRIL的外源多肽氨基酸序列。经过生物信息学分析,通过人工合成获得sAPRIL结合肽,进一步ELISA鉴定结合肽与sAPRIL间的亲和力。2.2 CCK-8法检测细胞增殖将阳性单克隆噬菌体扩增液及合成的sAPRIL结合肽分别以4个不同浓度梯度作用于LOVO和SW620细胞,并用CCK-8试剂盒进行增殖检测。接种处理好的各单细胞悬液于96孔板,每孔200ul RPMI-1640完全培养基含2×103个细胞,每个浓度梯度设3个复孔及1个对照孔,各孔加入CCK-8溶液20ul,继续培养,分别在24h、48h、72h后在450nm波长下,分光光度计测定各孔光吸收值,记录结果,以时间为横轴,光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线,数据以mean±SD表示。2.3流式细胞术检测细胞周期LOVO细胞调整浓度为1×105个/ml,加入sAPRIL结合肽20nM.40nM,设不加药的对照组,用不含EDTA0.25%胰酶将细胞消化下来,收集不同药物浓度处理及对照组的细胞。用1 ml培养基重悬细胞并计数,1200转离心5mmin。用预冷PBS洗涤细胞2次(2000rpm,5min),细胞加9倍体积预冷的70%乙醇,于4℃固定24小时。离心收集细胞后,用1ml的PBS洗细胞以除去乙醇,50ug/ml溴化乙锭(PI), 100ug/ml Rnase A,0.2% Triton X-100,4℃避光孵育30min。流式细胞仪激发波长488nm处检测细胞周期含量。2.4流式检测细胞凋亡LOVO细胞传代,调整细胞浓度为1×105个/ml,分到6孔板,每孔1000ul,即每孔细胞为1×105个。次日加入sAPRIL结合肽OnM,20nM,40nM。细胞培养箱孵育2天后用不含EDTA胰酶消化,收集不同药物浓度处理的细胞。用1ml培养基重悬细胞并计数用PBS洗涤细胞2次(2000rpm离心5min)后,收集1-5×105细胞；加入500μL的Binding Buffer悬浮细胞；再加入5μL Annexin V-FITC混匀后,加入5μL Propidium Iodide,混匀；室温、避光、反应5-15min；荧光显微镜和流式细胞仪下观察和检测。2.5裸鼠成瘤及瘤体检测实验LOVO细胞消化传代,培养至对数生长期,密度约为80%；台盼蓝证实细胞活力>95%,用PBS制备成2×107/ml细胞悬液；15只BALB/c裸鼠,无菌条件下饲养,注射0.1ml LOVO细胞悬液于裸鼠肩胛部皮下,均在半小时内完成；每3天测量一次瘤体直径,成瘤标准为皮下结节直径>5mmm,裸鼠3周后成瘤。满足成瘤标准后随机分为3组：sAPRIL结合肽高浓度组、sAPRIL结合肽低浓度组以及PBS对照组,每组5只；分别对实验组和对照组注射100ul浓度4000nM、2000nM的sAPRIL结合肽及100ulPBS。每2天瘤内注射1次,处理2周共7次,每次注射之前测量瘤体体积,绘制以时间为横轴,瘤体体积为纵轴的生长曲线。根据移植瘤体积变化计算肿瘤倍增时间。于注射结束后1周内处死全部裸鼠,取裸鼠肿瘤组织称重计算肿瘤生长抑制率。2.6 western blotting检测sAPRIL在结肠癌细胞株的表达提取细胞总蛋白,BCA法测定蛋白浓度,配制10%蛋白电泳分离胶和5%积层胶,上样顺序及上样量：M 4ul、SW620 10ul、LOVO 10ul、HCT116 8ul、HT-29 8ul、SW480 6ul,恒压80V 50分钟,120V恒压电泳直至溴酚蓝跑至胶底部。60分钟恒流半干电转膜,5%脱脂奶粉室温封闭1h,5%的脱脂奶粉/TBST1:1000稀释一抗(抗sAPRIL单克隆抗体),与PVDF膜4℃孵育过夜,TBST洗涤,同样方法1：5000稀释二抗(HRP标记羊抗大鼠IgG)37℃孵育1h, TBST洗涤后,将化学荧光发光底物均匀地加到膜的表面,使反应持续5min后,放至暗盒显影。2.7统计学分析结果均经SPSS13.0软件统计分析。增殖抑制实验和流式细胞术实验均取3次结果；裸鼠移植瘤实验每组5只测量14天内肿瘤体积；肿瘤倍增时间和瘤重均以mean±SD进行统计描述,整体检验用重复测量的方差分析,细胞增殖抑制实验各时间点不同浓度组间；流式细胞术各浓度不同细胞周期组间；裸鼠各结合肽浓度不同作用时间组体积比较均采用one-way ANOVA分析,先做方差齐性检验,方差不齐时用B-F法,两两比较方差齐时用LSD,不齐时用Dunnett’sT3;所有的统计结果以P<0.05作为有统计学意义。结果1噬菌体淘洗结果采用直接淘洗法,以sAPRIL蛋白为靶分子,对噬菌体12肽文库进行4轮筛选,获得与sAPRIL结合的噬菌体克隆,采用ELISA法鉴定随机挑选出来的20个单克隆与靶分子蛋白的结合力,得出高结合力的8个阳性克隆,将阳性噬菌体单克隆进行扩增和滴度测定,并进行DNA测序及生物信息学分析。8个阳性克隆基因中插入的外源DNA序列分别得到3个共同的融合序列：编号P12-5、P12-11、P12-12、P12-13的阳性克隆得到的共同序列为GCT GCG GCT CCG CTT GCGCAG CCT CAT ATG TGG GCG;编号P12-8、P12-16的共有序列为TCTAGT ACT ACT ACT AGT GAT AAG TAT CTT AGT GCG,编号P12-9的序列为TCT AAT CTG CAT GAT AAT AAT ACG GAG AAG AAT GTG。根据这3个插入的外源DNA序列推导出呈现的多肽氨基酸序列,核心序列分别为AAAPLAQPH MWA, SSTTTSDKYLSA, SNLH DNNTEKNV。结合前期的ELISA亲和力实验结果发现,编号P12-5、P12-11、P12-12、P12-13的阳性克隆的OD值较其他单克隆高,可推断与sAPRIL的结合力也相对较高,故选取它们的共同序列AAAPLAQPHMWA进行人工合成及后期的体内外增殖实验,通过这一序列人工合成sAPRIL结合肽,多肽纯度>95%。经进一步的ELISA亲和力鉴定,确认其与sAPRIL蛋白有较强的结合力。2 sAPRIL结合噬菌体及sAPRIL结合肽对大肠癌细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡的影响2.1 sAPRIL蛋白在大肠癌LOVO、HCT116、SW620、HT-29及SW480细胞的表达通过Western-Blot检测发现,sAPRIL蛋白在LOVO和HCT116细胞中相对高表达；在SW480、SW620和HT-29细胞中相对低表达。2.2 sAPRIL结合噬菌体及sAPRIL结合肽可抑制大肠癌LOVO细胞增殖为研究sAPRIL结合噬菌体及sAPRIL结合肽是否能够抑制其相关肿瘤细胞的增殖,在Western-Blot检测后,分别选取sAPRIL相对高表达的LOVO细胞和相对低表达的SW620细胞进行体外增殖实验,将两种细胞分别接种于96孔板,分别加入1.0×105pfu/ml、1.5×105pfu/ml、2.0×105pfu/ml和2.5×105pfu/ml不同浓度梯度的噬菌体,采用CCK-8法在24h、48h、72h时间点观察LOVO细胞和SW620细胞的增殖情况。结果显示,LOVO细胞在48h和72h时间点不同浓度组间差异有显著意义(24h:F=0.421, P=0.790; 48h:F=79.111, P=0.000; 72h: F=5.343, P=0.014);并呈时间依赖性(F=368.265,P=0.000)；抑制率随浓度的增高而逐渐增大。而对sAPRIL低表达的SW620细胞则未见明显抑制。在检测sAPRIL结合肽对大肠癌细胞增殖影响的实验中,两种细胞分别加入1nM,10nM, 20nM,40nM的结合肽,在24h、48h、72h时间点观察,结果显示,LOVO细胞在48h和72h时间点不同浓度组间差异有显著意义(48h:F=22.188, P=0.000; 72h:F=13.731, P=0.000);具有时间依赖性(F=899.979,P=0.000)；抑制率随浓度的增高而逐渐增大。而结合肽对SW620细胞无显著抑制。2.3 sAPRIL结合肽对大肠癌LOVO细胞周期及凋亡的影响为了解sAPRIL结合肽对LOVO细胞周期的影响,根据细胞增殖实验结果,选用20nM和40nM浓度的结合肽作用于LOVO细胞,分别在Oh、24h、48h进行细胞周期检测。结果显示与未加药的对照组相比,sAPRIL结合肽作用于LOVO细胞24h和48h后,Go/G1期细胞比例显著降低(24h:F=150.009, P=0.000; 48h: F=341.732;P=0.000),G2/M期细胞比例显著增加(24h:F=211.045, P=0.000; 48h: F=228.347, P=0.000)。提示结合肽能引起LOVO发生G2/M期阻滞,sAPRIL可能是通过诱导G2/M期阻滞而发挥增殖抑制效应。观察加入20nM和40nM sAPRIL结合肽的大肠癌细胞48小时的细胞凋亡情况,结果显示有凋亡趋势,但经多重比较分析与对照组比较无显著差异(F=4.703,P=0.059)。3 sAPRIL结合肽对裸鼠移植瘤生长的影响通过皮下注射LOVO细胞构建裸鼠大肠癌移植瘤模型,15只BALB/c裸鼠,无菌条件下饲养,注射0.1ml细胞悬液于裸鼠肩胛部皮下,每3天监测一次瘤体大小,成瘤标准为皮下结节直径>5mmm。满足成瘤标准后随机分为3组：sAPRIL结合肽高浓度组、sAPRIL结合肽低浓度组及PBS对照组；分别对实验组和对照组注射100ul浓度2000nM、4000nM的结合肽及100ul PBS。共处理2周,每次注射前测量瘤体体积(瘤体体积=瘤体长径×瘤体短径2/2),采用SPSS13.0软件拟合移植瘤体积变化曲线,求出肿瘤倍增时间,3组分别为：8.54±0.86；10.78±1.26；12.81±1.06,差异有统计学意义(F=19.92,P=0.000)。于注射结束后1周,处死全部裸鼠,切取裸鼠肿瘤组织称重,以便计算肿瘤生长抑制率[肿瘤生长抑制率=(1-实验组瘤重/对照组瘤重)×100%]。结果显示,注射sAPRIL结合肽后,从第8天开始肿瘤体积显著缩小(D8:F=6.608, P=0.012; D10:F=6.571, P=0.012; D12:F=8.469, P=0.005; D14:F=21.24, P=0.000);肿瘤倍增时间逐渐延长(F=19.92,P=0.000)；实验组瘤体明显较对照组缩小,高浓度组抑瘤率28.96%,低浓度组抑瘤率45.45%。结论本研究在表达和纯化人sAPRIL的基础上,通过对随机12肽噬菌体文库的筛选获得了与sAPRIL有高亲和力的噬菌体克隆,经扩增、测序,获得这些克隆基因中插入的外源DNA序列,根据外源DNA序列进一步推导出相应的氨基酸序列,分别是AAAPLAQPHMWA, S S T T T S D K Y L S A, SNLHDN NTEKNV。并根据序列AAAPLAQPHMWA成功合成sAPRIL结合肽,经生物信息分析后进行体内外实验。将合成的sAPRIL结合肽运用于体外和裸鼠移植瘤模型上,验证其对sAPRIL高表达大肠癌细胞增殖的影响。首先采用CCK-8法证实sAPRIL结合噬菌体及sAPRIL结合肽对大肠癌LOVO细胞增殖有显著抑制作用,然后通过流式细胞术进行LOVO细胞周期及凋亡的检测,进一步发现sAPRIL结合肽可能是通过诱导LOVO细胞G2/M期阻滞而发挥增殖抑制效应,最后建立裸鼠LOVO细胞移植瘤模型,使用sAPRIL结合肽进行处理,通过瘤体体积生长曲线了解结合肽对LOVO细胞移植瘤生长的影响,并通过肿瘤倍增时间和抑瘤率证实sAPRIL结合肽对LOVO移植瘤生长有显著抑制作用。本研究通过噬菌体筛选技术和生物信息学分析,揭示了sAPRIL作用于大肠癌LOVO细胞的靶位点；进一步通过体内外实验,探索了sAPRIL高表达肿瘤靶向治疗的新途径。由于APRIL分子被发现和研究的时间并不长,故最终将sAPRIL结合肽制剂运用于相关肿瘤的靶向治疗,还需要更进一步的研究。