论文部分内容阅读
目的:本课题将探讨CagA是否通过与YWHAE的相互作用激活MAPK通路及对细胞效应的影响,进一步完善CagA在胃癌中作用机制研究,为H.pylori相关胃癌的防治提供新思路。方法:1 CagA重组腺病毒感染细胞效率的确定Ad-CagA、Ad-GFP分别以不同浓度感染AGS细胞,确定最适MOI值。将Ad-GFP、Ad-CagA分别感染YWHAE低表达(AGS-siYWHAE,本室保存的YWHAE低表达细胞株)和YWHAE过表达的AGS细胞(AGS-myc-YWHAE,使用本室构建的pcDNA3.1-myc-YWHAE质粒转染AGS细胞),Western blot检测CagA蛋白的表达效果。2 CagA-YWHAE互作对MAPK通路激活的确定MAPK信号通路主要包括:ERK、p38、JNK通路2.1 Western blot检测CagA-YWHAE互作对MAPK通路激活的影响将Ad-GFP、Ad-CagA分别感染YWHAE低表达和过表达的AGS细胞,Western-blot检测细胞pERK、ERK、pp38、p38、pJNK、JNK表达水平。2.2 U0126(ERK上游抑制剂)验证CagA-YWHAE互作可激活ERK/MAPK通路将Ad-GFP、Ad-CagA分别感染YWHAE低表达和过表达细胞,再使用U0126处理细胞,Western blot检测细胞pERK、ERK表达水平。3 CagA-YWHAE互作激活ERK/MAPK通路对细胞效应的影响3.1 CagA-YWHAE互作抑制细胞凋亡依赖于ERK/MAPK通路H.pylori菌株NCTC11637及NCTC11637△cagA分别感染YWHAE低表达细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡。U0126预处理YWHAE过表达细胞,NCTC11637及NCTC11637△cagA分别感染上述细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡。3.2 CagA-YWHAE互作诱导细胞表达IL-8依赖于ERK/MAPK通路课题组已初步验证CagA-YWHAE互作诱导细胞IL-8的表达;U0126预处理YWHAE过表达细胞,NCTC11637及NCTC11637△cagA分别感染上述细胞,ELISA检测细胞IL-8的表达。结果:1确定CagA腺病毒感染细胞的效率成功获得扩增至第四代的Ad-CagA重组腺病毒,MOI=50时感染效率最佳;Western blot检测结果显示,在YWHAE低表达细胞和YWHAE过表达细胞CagA蛋白均可表达。2 CagA-YWHAE互作激活ERK/MAPK通路Ad-CagA感染的AGS-siNC细胞ERK磷酸化水平显著高于Ad-GFP感染的细胞(P﹤0.05);Ad-CagA感染的AGS-siYWHAE细胞ERK磷酸化水平与AdGFP感染的细胞比无显著差异;Ad-CagA感染的AGS-siYWHAE细胞ERK磷酸化水平比感染的AGS-siNC细胞显著下降(P﹤0.05)。Ad-CagA与Ad-GFP感染YWHAE过表达细胞得到相似结果。提示,CagA-YWHAE互作激活ERK/MAPK通路。Ad-CagA感染的AGS-siNC细胞,U0126处理组ERK磷酸化水平比DMSO处理组下降显著(P﹤0.05);Ad-CagA感染的AGS-siYWHAE细胞,U0126处理组ERK磷酸化水平与DMSO处理组比无显著性。Ad-CagA与Ad-GFP感染YWHAE过表达细胞得到相似结果。证明,CagA-YWHAE互作可激活ERK/MAPK通路。Ad-CagA感染的AGS-siNC细胞和AGS-siYWHAE细胞,p38磷酸化水平都显著高于Ad-GFP感染的细胞(P﹤0.05);但Ad-CagA感染的AGS-siYWHAE细胞p38磷酸化水平与感染的AGS-siNC细胞比没有显著改变。Ad-CagA与AdGFP感染YWHAE过表达细胞得到相似结果。表明,CagA可以激活p38/MAPK通路,但并非由YWHAE介导。Ad-CagA感染的AGS-siNC细胞和AGS-siYWHAE细胞,JNK磷酸化水平都显著高于Ad-GFP感染的细胞(P﹤0.05);但Ad-CagA感染的AGS-siYWHAE细胞JNK磷酸化水平与感染的AGS-siNC细胞比没有显著改变。Ad-CagA与AdGFP感染YWHAE过表达细胞得到相似结果。表明,CagA可以激活JNK/MAPK通路,但并非由YWHAE介导。3 CagA-YWHAE互作激活ERK/MAPK通路对细胞效应的影响3.1 CagA-YWHAE互作抑制细胞凋亡依赖于ERK/MAPK通路NCTC11637感染的AGS-siNC细胞细胞凋亡率显著低于NCTC11637△cagA感染的细胞(P﹤0.05);NCTC11637感染的AGS-siYWHAE细胞细胞凋亡率与NCTC11637△cagA感染的细胞比无显著差异;NCTC11637感染的AGS-siNC细胞细胞凋亡率比感染的AGS-siYWHAE细胞显著下降(P﹤0.05)。表明,CagAYWHAE互作抑制细胞凋亡。NCTC11637感染的AGS-myc-YWHAE细胞和AGS-myc细胞,U0126处理组细胞凋亡率都显著高于DMSO处理组(P﹤0.05)。证实,ERK上游抑制剂能有效抑制CagA-YWHAE互作抗细胞凋亡的作用。3.2 CagA-YWHAE互作诱导细胞表达IL-8依赖于ERK/MAPK通路NCTC11637感染的AGS-myc-YWHAE细胞和AGS-myc细胞,U0126处理组IL-8的表达都显著低于DMSO处理组(P﹤0.05)。证实,ERK上游抑制剂能有效抑制CagA-YWHAE互作对IL-8的诱导作用。结论:1、CagA-YWHAE互作可激活ERK/MAPK通路。2、CagA-YWHAE互作抑制细胞凋亡依赖于ERK/MAPK通路。3、CagA-YWHAE互作诱导细胞IL-8的表达依赖于ERK/MAPK通路。