由于创伤、肿瘤及退行性变等各种原因导致的关节软骨损伤在临床上常见,然而由于软骨细胞属于终末分化细胞,软骨本身缺乏血管营养等原因导致软骨组织很难自身修复,从而容易导致关节功能障碍乃至骨关节炎的发生。目前临床上修复关节软骨损伤常用的方法如关节腔清理术、关节磨削成形术、软骨下骨钻孔术及微骨折术等均存在一定不足；而自体或异体软骨细胞移植也存在来源受限及不同程度免疫排斥等问题；比较而言,软骨组织工程无疑是最有发展前景的前沿技术。本课题通过研究以人脐带沃顿胶组织脱细胞后制作新型生物软骨支架,对支架成分、理化性能及生物学性能进行检测,并进行支架复合脐带间充质干细胞体外成软骨的研究,根据组织工程的基本原理体外构建组织工程软骨,以期为软骨组织工程的深入研究和发展提供一定的理论依据和实验基础。第一章以人脐带沃顿胶为原材料制作新型生物软骨支架目的研究以人脐带沃顿胶制作新型生物软骨支架的可行性,并进行支架的外形及显微结构的观察,是否附合软骨支架的基本要求,为软骨组织工程支架研究提供实验基础。方法获取分娩后胎儿脐带,分离出脐带沃顿胶组织,采用酶消化法联合物理冻融法脱细胞,再经冷冻干燥成型法制作软骨支架,并行支架HE染色及SEM照片观察。结果经冷冻干燥后得到支架材料为多孔泡沫状圆柱体结构、呈白色较疏松海绵样物质,大体观察支架表面孔隙较多,HE染色及SEM照片可以看到,沃顿胶经过去细胞化冷冻干燥后得到的生物软骨支架,脱细胞完全,其表面呈多孔状纵横交错的网状三维结构。扫描电镜显示支架呈多孔泡沫状,孔隙分布较均匀,材料内空隙相互连通。结论本部分实验通过对人脐带沃顿胶进行脱细胞处理后经冷冻干燥成型术成功制备了三维多孔海绵样支架,去细胞彻底,支架呈三维多孔网状结构,孔隙分布较均匀,材料内空隙相互连通,可作为软骨组织工程的支架载体。第二章新型生物软骨支架成分分析及一般理化性能的检测目的通过对支架成分的分析及其理化性能的检测,研究支架是否与软骨基质成分相似,是否附合软骨支架的理化性能要求。方法支架成分应用二甲基亚甲兰法进行GAGs定量检测、通过ELISA法对支架的Ⅱ型胶原含量进行定量检测。并测定支架的孔径、孔隙率、密度、溶胀率、降解率等。结果三维多孔海绵样支架GAGs含量为254.1±18.8ug/mg,Ⅱ型胶原含量为742.8±74.4ug/mg。支架孔径为105.2土12.8umm；孔隙率为90.3土1.2%；支架密度为0.0848±0.0091mg/mm3,吸水溶胀率为1042.0+38.2%,亲水性良好。支架降解率2周为17.2±1.3%,4周为37.6±2.5%。结论支架的主要成分为Ⅱ型胶原及GAGs,与软骨基质成分接近,支架的孔径、孔隙率、密度、溶胀率、降解率等均附合软骨支架的要求。第三章新型生物软骨支架的生物学性能的检测目的通过对制备出的新型生物材料支架的毒性试验及生物相容性进行检测,探讨其作为软骨组织工程支架材料的可行性。方法提取支架的浸提液行皮内刺激试验、热原试验、溶血试验,采用MTT法检测不同浓度材料浸提液对细胞的毒性。细胞与支架复合后MTT法检测对细胞毒性：支架复合脐带间充质干细胞后诱导培养,于接种后4、8、12、24小时取样测定细胞在支架上黏附率；分别于2、4、8天取样后与对照组比较,采用MTT法分析复合支架对细胞增殖的影响；并行裸鼠皮下包埋实验检测支架的组织相容性。结果提取液行皮内刺激实验示材料的原发刺激指数(PⅡ)为0.11,支架无刺激；热原实验中实验动物体温升高均在0.2℃以下,符合热原试验的评价标准；溶血试验示溶血率为4.19%,支架材料无溶血作用；采用MTT法检测材料浸提液对细胞的毒性示细胞培养1、3、5、7、9天不同浓度浸提液与对照组比较,对细胞的生长无明显影响(P>0.05),在不同浓度支架浸提液中细胞相对增殖度(RGR)平均为98,毒性评价为1级。支架材料接种细胞悬液后,与对照组比较MTT法显示支架对细胞生长无抑制作用(P>0.05),不同时间点RGR为93.6～98.8,毒性评介为1级；实验组与对照组的脐带间充质干细胞生长增殖活性随着时间延长而增加；细胞计数结果显示随时间延长材料上细胞黏附率逐渐增高,当复合培养12h后,细胞粘附率>95%；皮下包埋实验4周后组织HE染色结果显示未见明显炎症反应。结论新型生物软骨支架的细胞粘附率高,无细胞毒性,具备生物安全性和良好的生物相容性,可作为软骨组织工程良好的细胞载体。第四章支架复合脐带间充质干细胞体外构建组织工程软骨的初步研究目的探讨支架复合脐带间充质干细胞体外初步构建组织工程软骨的可能性。方法取第3代脐带间充质干细胞,将脐带间充质干细胞与预处理的支架复合培养；实验分为三组,A组：脐带间充质干细胞复合本支架材料、定向成软骨诱导；B组：脐带间充质干细胞复合本支架材料、未进行定向成软骨诱导；C组：脐带间充质干细胞复合P(LLA-CL)聚合物支架、未定向成软骨诱导。细胞根据分组不同分别加入成软骨诱导培养基和普通培养基进行培养。复合培养3周后取出细胞支架复合物,将复合物切片进行HE染色、甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色；RT-PCR检测各组复合物培养7、14、21天表达Sox-9、Co12a1及aggrecan mRNA的情况；Western-blot检测前Ⅱ型胶原蛋白及aggrecan蛋白表达。结果细胞-材料复合体外培养3周后HE染色可见A组细胞分泌基质多,有软骨样基质形成；B组细胞分泌基质亦较多,有软骨样基质形成；C组则未见陷窝样结构,细胞分泌基质较少。甲苯胺蓝染色可见A组细胞及细胞外基质呈蓝色异染为强阳性；B组细胞及细胞外基质呈蓝色异染为阳性；C组染色为淡蓝色,异染不明显；Ⅱ型胶原免疫组化染色显示A组大量细胞内外均有棕黄色着色呈强阳性；B组细胞内外有棕黄色着色呈阳性；而C组可见个别细胞胞浆内散在棕色呈弱阳性。RT-PCR检测结果显示随着培养时间延长Sox-9、Co12a1及aggrecan mRNA表达逐渐增强,各时间点A组和B组,B组与C组,A组与C组两两比较mRNA表达均有统计学差异(P<0.05)；Western-blot显示诱导组复合物中A组与B组前Ⅱ型胶原蛋白及aggrecan蛋白随着培养时间延长表达逐渐增强,而对照组C蛋白无表达,但各时间点A组与B组比较蛋白表达水平均有统计学差异(P<0.05)；结论支架复合脐带间充质干细胞在体外经成软骨诱导可初步构建组织工程软骨,而且脐带间充质干细胞复合新型生物软骨支架在未经成软骨诱导时亦有自发成软骨倾向。新型生物软骨支架为软骨损伤修复提供了新的途径。