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胶原蛋白是结缔组织中极其重要的结构蛋白质,对维护细胞、组织及器官的正常生理功能有着重要作用。胶原蛋白被广泛的应用于医学材料及药物方面、美容化妆品、保健品以及各种实用工业中。目前胶原蛋白家族大约有28个成员。其中,Ⅵ型胶原蛋白是细胞外基质蛋白,在维持骨骼肌功能的完整性具有关键作用。Ⅵ型胶原蛋白是由3条不同的a-肽链α1、α2、α3组成的异三聚体,如果Ⅵ型胶原蛋白的第二条α肽链COL6A2基因突变,将会导致形成乌尔里希先天性肌营养不良症(UCMD),导致肌肉无力并消瘦。由此可见,COL6A2基因对Ⅵ型胶原蛋白的活性功能有着重要影响。目的：通过基因工程技术,构建含有目的基因COL6A2-005的真核表达载体,并使其在毕赤酵母中表达,通过纯化获得重组蛋白,为深入研究Ⅵ型胶原蛋白的活性功能及其生产奠定基础。方法：用PCR方法以Ⅵ型胶原蛋白基因组DNA为模板,获得Ⅵ型胶原蛋白α2链COL6A2-005基因,并将该基因插入到表达载体pPIC9K,对重组质粒pPIC9K-COL6A2-005所含的目的片段进行双向测序。将测序正确的重组质粒用限制性内切酶Sal I线性化,经电击转化到毕赤酵母GS115感受态细胞中。通过MM/MD法进行甲醇利用表型的筛选,利用PCR法鉴定目的基因是否同源整合,以G418梯度平板筛选高拷贝转化菌,并对其进行稳定性研究。在酵母α-Factor及AOX1基因启动子和终止信号的调控下,目的蛋白分泌表达到胞外。从初始菌浓度、甲醇添加量、培养基初始pH值和最终的收获时间等方面对重组酵母菌株的诱导表达条件进行优化。再通过凝胶过滤色谱Sephadex G75将表达出的目的蛋白进行纯化。结果：成功构建含有COL6A2-005基因的毕赤酵母工程菌株。该重组蛋白分子质量为32kD。经过正交试验分析,得到重组毕赤酵母工程菌株产类人胶原蛋白的最佳诱导条件：初始菌浓度OD=1.0,初始pH为6.6,甲醇添加量0.25%/24h,收获时间为60h,表达量为39.77mg/L。通过凝胶过滤色谱Sephadex G75将表达出的目的蛋白进行纯化,重组蛋白经过凝胶电泳分析软件鉴定纯度达到90%以上。