研究背景和目的：调节性T细胞(regulatory T cells, Treg)作为一类具有免疫调节功能的成熟T细胞亚群,在机体免疫反应过程中可通过对细胞免疫抑制发挥关键调控作用。与其他免疫细胞相比,CD4+CD25+Treg具有独特的免疫特征,主要介导免疫抑制反应,通过T细胞受体信号刺激活化后引起辅助性T细胞(Th)1/Th2的漂移,进而影响炎症结局。业已明确,一些可溶性分子和膜结合分子对Treg功能活性的发挥具有重要作用,包括白介素(IL)-2、IL-10、转化生长因子(TGF)-β、T淋巴细胞毒性相关抗原(CTLA)-4及糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)等。同时,叉头翼状螺旋转录因子(Foxp3) mRNA及编码蛋白质特异性表达于CD4+CD25+Treg,直接影响Treg的表型及活性,可作为鉴定CD4+CD25+Treg最可靠的标志。与Foxp3相似,另一转录因子——活化T细胞核因子(NF-AT)也参与CD4+CD25+Treg的免疫调节过程,并在Treg的发育及功能活性的发挥中起着重要作用。肿瘤坏死因子-α诱导蛋白-8样分子2(tumor necrosis factor-α induced protein8like-2, TIPE2)作为一种新发现的蛋白分子,与肿瘤坏死因子-α诱导蛋白-8家族成员拥有共有序列,被视为此家族成员之一。TIPE2选择性表达于淋巴源性和髓源性细胞,主要表现为对固有免疫及细胞免疫的负向调节作用,抑制激活蛋白(AP)-1和核因子(NF)-KB的活化,且TIPE2基因缺陷细胞呈现出对Toll样受体(Toll-like receptor, TLR)和T细胞受体信号活化的高反应性。在小剂量脂多糖(LPS)诱导脓毒症小鼠模型中,TIPE2基因敲除组出现明显脓毒性休克反应,并且TIPE2基因表达下调引起持续性淋巴细胞活化,Fas表达增强,促进淋巴细胞凋亡,并引起IL-4、IL-6、IL-12和干扰素(IFN)-γ等细胞因子的生成增多,但TIPE2表达是否影响Treg的免疫功能迄今尚不清楚。本实验采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot等技术初步检测TIPE2在CD4+CD25+Treg中的表达情况。通过小片段干扰RNA (siRNA)技术沉默Treg细胞中TIPE2表达,观察其对Foxp3、CTLA-4、IL-2、IL-10、TGF-β等免疫相关分子的影响。此外,将CD4+CD25+Treg与CD4+CD25-T细胞共培养,进一步分析Treg细胞中TIPE2表达改变对CD4+CD25-T细胞抑制效应的影响,并通过检测(?)Th1(IFN-γ)及Th2(IL-4)型细胞因子了解T细胞功能极化的变化。该实验旨在明确TIPE2对Treg介导T淋巴细胞免疫抑制功能的影响,为寻求严重感染并发症的防治途径提供新思路。方法：1.采用免疫磁珠法分离正常BALB/C小鼠脾脏CD4+CD25+Treg及CD4+T细胞,流式细胞术鉴定CD4+CD25+Treg细胞纯度。2.设正常CD4+CD25+Treg细胞组及阳性对照组CD4+T细胞,激光扫描共聚焦显微镜观察Treg细胞内TIPE2蛋白表达情况并进行初步定位；取分离出的Treg细胞与CD4+T细胞,同时按照总蛋白提取试剂盒从两组细胞中提取总蛋白,采用BCA法进行蛋白定量,设阳性、阴性对照组分别为CD4+T细胞和肝脏组织。Western blot法进一步检测Treg细胞中TIPE2蛋白表达水平。此外,采用Trizol法提取小鼠CD4+CD25+Treg和CD4+T细胞(作为阳性对照)总RNA,进行RT-PCR分析,在不加反转录酶的情况下(RT-),用Treg细胞总RNA进行逆转录、扩增,CD4+T细胞TIPE2mRNA作为阳性对照,(3-actin作为内参照。从基因水平检测检测Treg细胞中TIPE2mRNA表达情况。3.通过siRNA技术沉默Treg细胞TIPE2基因表达。分别设siRNA-TIPE2转染后Treg细胞组、正常Treg细胞组、siRNA-TIPE2转染后Treg细胞组；采用流式细胞术分析CD4+CD25+Treg细胞表面标记物CTLA-4和转录因子Foxp3的表达变化,24小时(h)后收集各组细胞上清液,应用ELISA分析Treg分泌IL-10和TGF-β的变化。4.部分细胞用于siRNA-TIPE2转染后,CD4+CD25+Treg/CD4+CD25-T细胞共培养(按1：1比例),另设空白对照组(CD4+CD25-T细胞)。调整细胞浓度接种于96孔板培养中,包被抗CD3和抗CD28激活细胞,MTT法检测CD4+CD25+Treg对CD4+CD25-T细胞的抑制效应。5.设siRNA-TIPE2转染后Treg细胞组、正常Treg细胞组、无意义序列转染Treg细胞组,按1：1比例分别与分离的CD4+CD25-T细胞混合,同时另设空白对照组(CD4+CD25-T细胞)。68h收集各组细胞培养上清,ELISA检测上清液中IL-2、IFN-γ/IL-4水平的变化；部分细胞分组检测核内NF-AT活性变化,分别设CD4+CD25-T对照组、Treg/CD4+CD25-T细胞共培养组、siRNA-TIPE2转染Treg/CD4+CD25-T细胞共培养组；scramble转染Treg/CD4+CD25-T细胞共培养组,68h后收集各组细胞ELISA检测核内NF-AT活性。6.统计学方法采用SPSS13.0统计软件对数据进行分析,计量资料用x±s表示,单因素多组数据进行方差分析(One-Way ANOVA),俩样本间比较采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。主要结果和结论：1.正常小鼠脾脏单核细胞经过MACS两次分选后,通过流式细胞仪检测得到CD4+CD25+Treg纯度可达92%。CD4+CD25+Treg经过台盼蓝染后检测,其活性大于98%。2.异硫氰酸荧光素(FITC)间接荧光标记TIPE2,激光共聚焦显微镜成像分析显示CD4+CD25+Treg细胞中表达TIPE2; Western blot检测证实CD4+CD25+Treg细胞检测到清楚的TIPE2条带,分子量约为21kD；RT-PCR分析发现,CD4+CD25+Treg细胞中检测到147bp大小的特异性TIPE2目的基因条带。3.抗CD3/CD28联合刺激CD4+CD25+Treg与siRNA-TIPE2转染CD4+CD25+Treg组24h后,CTLA-4平均荧光强度在TIPE2沉默CD4+CD25+Treg细胞组显著下降(t=13.596,P=0.000)。此外,Foxp3被视为CD4+CD25+Treg细胞的特异性标志,Foxp3基因突变可直接导致CD4+CD25+Treg功能缺陷及出现致命性自身免疫状态。本实验中流式细胞分析结果显示,Foxp3平均荧光强度在siRNA-TIPE2转染CD4+CD25+Treg组出现显著下降(t=28.833,P=0.000)。由此可见,沉默CD4+CD25+Treg细胞TIPE2表达后CTLA-4和Foxp3均呈现表达下调的变化趋势,初步说明Treg细胞中TIPE2水平影响其标记物CTLA-4和Foxp3的表达,且两者的变化呈平行关系。4.ELISA结果显示：抗CD3/CD28联合刺激CD4+CD25+Treg与siRNA-TIPE2专染CD4+CD25+Treg组24h后,转染组细胞上清液中检测到较低水平IL-10、TGF-β,与正常CD4+CD25+Treg细胞比较均有统计学差异(t=8.054,P=0.000；t=6.454,P=0.000)。许多研究证实,在Treg细胞介导的免疫耐受过程中免疫抑制因子IL-10和TGF-β发挥关键作用。本实验中,沉默CD4+CD25+Treg细胞TIPE2基因表达后,联合抗CD3/CD28刺激条件下观察CD4+CD25+Treg细胞分泌IL-10和TGF-β的变化情况。结果显示,TIPE2基因沉默后细胞上清液中IL-10和TGF-β水平与正常组细胞相比均出现显著下调,表明CD4+CD25+Treg细胞TIPE2表达可能影响其抑制性细胞因子的生成。5. CD4+CD25-T细胞为主要的效应性T细胞,其增殖活性对于维持正常的免疫应答起着重要作用。本组资料中,通过T细胞增殖试验进一步观察了TIPE2对CD4+CD25+Treg抑制功能的影响。采用MTT检测结果发现,在抗CDS/CD28联合刺激下,与效应性T细胞单独培养组相比,加入CD4+CD25+Treg细胞后T细胞增殖活性显著下降(P=0.000)。通过siRNA沉默CD4+CD25+Treg细胞TIPE2蛋白表达,siRNA-TIPE2转染CD4+CD25+Treg组T细胞增殖活性反而增强(P=0.000)。在CD4+CD25+Treg与CD4+CD25-T共培养后,T细胞增殖能力明显受到抑制,提示TIPE2基因沉默后CD4+CD25+Treg的免疫抑制功能有所减弱。6.无意义序列scramble转染CD4+CD25+Treg/CD4+CD25-T细胞共培养组与正常Treg组比较,反映T淋巴细胞增殖活性的OD540值没有统计学差异(P>0.05)：siRNA-TIPE2转染CD4+CD25+Treg后与CD4+CD25-T细胞共培养,68h检测共培养上清中IL-2的浓度变化。结果显示,CD4+CD25-T细胞分泌—定量的IL-2,加入CD4+CD25+Treg细胞后其水平明显下降(P=0.000),但siRNA-TIPE2转染CD4+CD25+Treg细胞组IL-2水平显著升高(P=0.000)。阴性对照组(scramble转染CD4+CD25+Treg细胞组)与CD4+CD25+Treg细胞组相近(P>0.05)。有资料证实,IL-2与T淋巴细胞增殖密切相关,T淋巴细胞通过自分泌、旁分泌或内分泌的形式产生IL-2,作用于自身或其他T淋巴细胞。Treg细胞除介导免疫抑制功能外,还具有免疫无能性,主要表现为对高浓度IL-2的单独刺激、固相包被或可溶性抗CD3单抗及抗CD3单抗/抗CD28单抗的联合作用呈无反应状态,也不分泌IL-2。共培养上清中IL-2由效应T细胞分泌,本实验中下调CD4+CD25+Treg细胞TIPE2表达后,CD4+CD25+Treg/CD4+CD25-T细胞共培养上清液IL-2水平较正常对照组明显升高,TIPE2表达可能与CD4+CD25+Treg细胞抑制效应T细胞分泌IL-2或加速IL-2的消耗有关,进而抑制T淋巴细胞的增殖。7.实验中siRNA-TIPE2转染CD4+CD25+Treg细胞后,极化Th2细胞能力减弱,IFN-γ/IL-4浓度比值上升,向Th1细胞方向极化(P=0.000)。培养上清中IFN-γ/IL-4比值较正常对照组有统计学差异。Treg介导的免疫抑制效应是经T细胞受体信号刺激活化后引起Th1/Th2的漂移,即IFN-γ/IL-4比值降低,极化Th2细胞。但本实验中,下调CD4+CD25+Treg细胞TIPE2表达显著增加了IFN-γ/IL-4比值,TIPE2可能参与了CD4+CD25+Treg介导的Th2极化过程。8.在CD4+CD25-T细胞中加入CD4+CD25+Treg后,转录因子NF-AT活性显著下降(P=0.000)；siRNA-TIPE2转染CD4+CD25+Treg组NF-AT活性则明显上调(P=0.000),说明TIPE2影响CD4+CD25-T细胞中转录因子NF-AT活化。一般认为,转录因子NF-AT家族被视为重要的调节因子之一,在调节细胞因子IL-2的转录及协调其他细胞因子表达中起核心作用。既往研究中我们发现在抗CD3单抗、抗CD28单抗的联合刺激下,CD4+CD25+Treg/CD4+CD25-T细胞共培养可显著下调T细胞转录因子NF-KB和NF-AT活性。在本部分实验中观察到沉默Treg细胞TIPE2基因表达后,CD4+CD25+Treg*CD4+CD25-T共培养体系中T细胞NF-AT活性反而明显上调,该结果提示TIPE2可能在CD4+CD25+Treg介导的抑制效应性T细胞NF-AT活化中发挥重要作用,从而进一步影响CD4+CD25+Treg细胞的免疫抑制效应。