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目的
创伤性脑损伤(Traumatic brain injury, TBI)引起脑组织缺损、神经元丢失，导致严重残疾和神经功能障碍，为患者本人和家庭带来极大的精神压力和经济负担。然而目前针对TBI仍没有确切有效的手段来修复受损的神经功能。研究发现，包括人类在内的成年哺乳动物大脑侧脑室下区(subventricular zone ， SVZ )和海马颗粒层下区(Subgranular zone, SGZ)存在神经干细胞(Neural stem cells)/神经前体细胞(Neuroblast)(以下统称神经前体细胞)。有趣的是，TBI在引起脑损伤的同时，也诱发、增强了这些神经前体细胞增殖和迁移等过程(神经发生)。研究脑损伤后神经发生机制，促进修复受损的神经功能，具有广阔的临床应用前景。膜联蛋白2(Annexin 2)是一种由ANXA2基因编码，与细胞骨架动力学关系密切，参与多种细胞存活、增殖、迁移以及信号转导的多效蛋白。最新文献报道Annexin2在TBI后具有神经保护作用，ANXA2基因缺陷小鼠TBI后具有更差的长期神经功能缺损。是否Annexin2参与了TBI后神经发生尚无报道。为此，本研究主要通过控制性皮层损伤(Controlled cortical impact，CCI)，建立小鼠中度TBI模型，检测Annexin2表达分布，以及干扰ANXA2表达对神经功能恢复的影响；在体外通过神经球和SVZ外植体(SVZ explants)培养，检测ANXA2表达对神经前体细胞增殖和迁移的作用；最后在体内、外通过应用重组膜联蛋白2(recombinant Annexin 2，rA2)干预，探讨Annexin2对神经前体细胞增殖、迁移作用的分子机制。
方法
1.检测成年人TBI大脑神经发生。筛选收集重庆医科大学法医学教研室标本库内TBI病史成年人伤侧SVZ附近脑组织，石蜡包埋固定、切片，免疫荧光实验同时检测Annexin2以及神经前体细胞标志物DCX，寻找成年人TBI神经发生证据及其与Annexin2表达的关系。
2.检测Annexin2在小鼠TBI后脑内的表达。60只C57BL/6成年雄性小鼠，随机分为sham组(n=12)和TBI组(n=48)，通过CCI建立中度TBI模型。免疫印迹实验检测sham小鼠和TBI小鼠CCI后第6小时，1、3、5、7、14、28天伤侧半球Annexin2表达变化趋势；免疫荧光实验检测CCI后第7天Annexin2在小鼠TBI后脑内表达分布。
3.检测Annexin2对小鼠TBI后神经功能恢复的影响。58只成年、雄性C57BL/6小鼠随机分成4组：sham组(n=13)，vehicle组(n=13)；siR-ANXA2组(n=16)；和siR-scramble组(n=16)。CCI前15天侧脑室注射ANXA2干扰腺相关病毒或对照试剂。分别在CCI前1天，CCI后第1、3、5、7、14、21天通过抓线实验(Wire grip test)和神经功能缺损评分(Neurological severity scores, NSS)检测小鼠感觉-平衡运动功能；CCI后第16天开始，通过莫氏水迷宫(Morris water maze, MWM)检测小鼠空间学习记忆功能恢复情况。
4.研究Annexin2在体外对神经前体细胞的增殖、迁移作用。从C57BL/6小鼠SVZ区提取神经前体细胞和SVZ外植体进行体外培养，应用ANXA2干扰和过表达腺病毒干预，通过免疫荧光实验检测BrdU阳性比例，探讨Annexin2对神经前体细胞增殖的作用；通过SVZ外植体迁移实验，检测神经前体细胞迁移距离，探讨Annexin2对神经前体细胞迁移的影响。
5.探讨Annexin2对神经前体细胞的增殖、迁移作用机制。体外培养的神经前体细胞中给与梯度浓度的rA2，免疫印迹实验检测对增殖迁移相关PDK1通路影响及其下游分子激活情况。应用PDK1抑制剂OSU-03012以及ANXA2干扰腺病毒，验证对PDK1-Akt-Girdin信号通路的作用；动物体内实验，24只成年雄性C57BL/6小鼠随机分成sham组、Control组、rA2组、rA2+OSU-03012组，每组6只。CCI后6小时开始通过侧脑室导管注射rA2或对照溶剂，并腹腔注射OSU-03012，每天1次，连续十天。并在CCI后第3天开始，以50mg/kg剂量BrdU，每天1次，腹腔注射，连续7天。通过免疫荧光实验，检测DCX、BrdU和NeuN指标，验证Annexin2通过PDK1信号通路促进了神经前体细胞增殖和迁移。
结果
1.所有3例成年人TBI后伤侧SVZ附近脑组织中均发现有DCX阳性神经前体细胞，并且这些细胞同时表达Annexin2。
2.小鼠CCI后伤侧半球Annexin2在第6小时即表达显著增高(**p<0.01),持续增加至第7天达到高峰(****p<0.0001)，然后逐渐降低。免疫荧光证实，增加的Annexin2表达主要分布在伤侧SVZ附近，并于SVZ区DCX阳性神经前体细胞和伤灶附近神经元共表达。
3.下调CCI后小鼠脑内Annexin2的表达，①增加了NSS评分和降低了抓线测试评分(****p<0.0001)；②增加了MWM定位航行实验中小鼠寻找隐藏平台的潜伏期(****p<0.0001)、降低了在隐藏平台耗时比例(*p<0.05)和减少了空间探索实验中小鼠穿越原隐藏平台位置次数(*p<0.05)。
4.体外实验，①下调神经前体细胞Annexin2表达，降低了神经球中BrdU阳性细胞比例(**P<0.01)和SVZ外植体中神经前体细胞迁移距离(***P<0.001)；②上调神经前体细胞Annexin2表达，增加了神经球中BrdU阳性细胞比例(****P<0.0001)和SVZ外植体中神经前体细胞迁移距离(####P<0.0001)。
5.免疫印迹实验表明rA2干预体外培养的神经前体细胞，增加了PDK1ser241和下游分子Aktser473,Girdins-1416磷酸化(****P<0.0001)。免疫荧光实验证实，侧脑室连续注射rA2，增加了SVZ区DCX阳性面积比例(####P<0.0001)，增加了伤灶周围DCX/NeuN双染细胞数量(****P<0.0001)、BrdU/NeuN双染细胞数量(***p<0.001)、SGZ区DCX阳性细胞数量(###p<0.001)和海马BrdU/NeuN双染细胞数量(##p<0.01),而PDK1抑制剂OSU-03012腹腔注射削弱了rA2的这一作用。
结论
TBI后Annexin2在小鼠伤灶附近和伤侧SVZ中表达增加，并通过PDK1-Akt-Girdin信号通路促进SVZ和SGZ的神经前体细胞增殖并引导SVZ神经前体细胞向伤灶迁移，最终促进小鼠神经功能恢复。
创伤性脑损伤(Traumatic brain injury, TBI)引起脑组织缺损、神经元丢失，导致严重残疾和神经功能障碍，为患者本人和家庭带来极大的精神压力和经济负担。然而目前针对TBI仍没有确切有效的手段来修复受损的神经功能。研究发现，包括人类在内的成年哺乳动物大脑侧脑室下区(subventricular zone ， SVZ )和海马颗粒层下区(Subgranular zone, SGZ)存在神经干细胞(Neural stem cells)/神经前体细胞(Neuroblast)(以下统称神经前体细胞)。有趣的是，TBI在引起脑损伤的同时，也诱发、增强了这些神经前体细胞增殖和迁移等过程(神经发生)。研究脑损伤后神经发生机制，促进修复受损的神经功能，具有广阔的临床应用前景。膜联蛋白2(Annexin 2)是一种由ANXA2基因编码，与细胞骨架动力学关系密切，参与多种细胞存活、增殖、迁移以及信号转导的多效蛋白。最新文献报道Annexin2在TBI后具有神经保护作用，ANXA2基因缺陷小鼠TBI后具有更差的长期神经功能缺损。是否Annexin2参与了TBI后神经发生尚无报道。为此，本研究主要通过控制性皮层损伤(Controlled cortical impact，CCI)，建立小鼠中度TBI模型，检测Annexin2表达分布，以及干扰ANXA2表达对神经功能恢复的影响；在体外通过神经球和SVZ外植体(SVZ explants)培养，检测ANXA2表达对神经前体细胞增殖和迁移的作用；最后在体内、外通过应用重组膜联蛋白2(recombinant Annexin 2，rA2)干预，探讨Annexin2对神经前体细胞增殖、迁移作用的分子机制。
方法
1.检测成年人TBI大脑神经发生。筛选收集重庆医科大学法医学教研室标本库内TBI病史成年人伤侧SVZ附近脑组织，石蜡包埋固定、切片，免疫荧光实验同时检测Annexin2以及神经前体细胞标志物DCX，寻找成年人TBI神经发生证据及其与Annexin2表达的关系。
2.检测Annexin2在小鼠TBI后脑内的表达。60只C57BL/6成年雄性小鼠，随机分为sham组(n=12)和TBI组(n=48)，通过CCI建立中度TBI模型。免疫印迹实验检测sham小鼠和TBI小鼠CCI后第6小时，1、3、5、7、14、28天伤侧半球Annexin2表达变化趋势；免疫荧光实验检测CCI后第7天Annexin2在小鼠TBI后脑内表达分布。
3.检测Annexin2对小鼠TBI后神经功能恢复的影响。58只成年、雄性C57BL/6小鼠随机分成4组：sham组(n=13)，vehicle组(n=13)；siR-ANXA2组(n=16)；和siR-scramble组(n=16)。CCI前15天侧脑室注射ANXA2干扰腺相关病毒或对照试剂。分别在CCI前1天，CCI后第1、3、5、7、14、21天通过抓线实验(Wire grip test)和神经功能缺损评分(Neurological severity scores, NSS)检测小鼠感觉-平衡运动功能；CCI后第16天开始，通过莫氏水迷宫(Morris water maze, MWM)检测小鼠空间学习记忆功能恢复情况。
4.研究Annexin2在体外对神经前体细胞的增殖、迁移作用。从C57BL/6小鼠SVZ区提取神经前体细胞和SVZ外植体进行体外培养，应用ANXA2干扰和过表达腺病毒干预，通过免疫荧光实验检测BrdU阳性比例，探讨Annexin2对神经前体细胞增殖的作用；通过SVZ外植体迁移实验，检测神经前体细胞迁移距离，探讨Annexin2对神经前体细胞迁移的影响。
5.探讨Annexin2对神经前体细胞的增殖、迁移作用机制。体外培养的神经前体细胞中给与梯度浓度的rA2，免疫印迹实验检测对增殖迁移相关PDK1通路影响及其下游分子激活情况。应用PDK1抑制剂OSU-03012以及ANXA2干扰腺病毒，验证对PDK1-Akt-Girdin信号通路的作用；动物体内实验，24只成年雄性C57BL/6小鼠随机分成sham组、Control组、rA2组、rA2+OSU-03012组，每组6只。CCI后6小时开始通过侧脑室导管注射rA2或对照溶剂，并腹腔注射OSU-03012，每天1次，连续十天。并在CCI后第3天开始，以50mg/kg剂量BrdU，每天1次，腹腔注射，连续7天。通过免疫荧光实验，检测DCX、BrdU和NeuN指标，验证Annexin2通过PDK1信号通路促进了神经前体细胞增殖和迁移。
结果
1.所有3例成年人TBI后伤侧SVZ附近脑组织中均发现有DCX阳性神经前体细胞，并且这些细胞同时表达Annexin2。
2.小鼠CCI后伤侧半球Annexin2在第6小时即表达显著增高(**p<0.01),持续增加至第7天达到高峰(****p<0.0001)，然后逐渐降低。免疫荧光证实，增加的Annexin2表达主要分布在伤侧SVZ附近，并于SVZ区DCX阳性神经前体细胞和伤灶附近神经元共表达。
3.下调CCI后小鼠脑内Annexin2的表达，①增加了NSS评分和降低了抓线测试评分(****p<0.0001)；②增加了MWM定位航行实验中小鼠寻找隐藏平台的潜伏期(****p<0.0001)、降低了在隐藏平台耗时比例(*p<0.05)和减少了空间探索实验中小鼠穿越原隐藏平台位置次数(*p<0.05)。
4.体外实验，①下调神经前体细胞Annexin2表达，降低了神经球中BrdU阳性细胞比例(**P<0.01)和SVZ外植体中神经前体细胞迁移距离(***P<0.001)；②上调神经前体细胞Annexin2表达，增加了神经球中BrdU阳性细胞比例(****P<0.0001)和SVZ外植体中神经前体细胞迁移距离(####P<0.0001)。
5.免疫印迹实验表明rA2干预体外培养的神经前体细胞，增加了PDK1ser241和下游分子Aktser473,Girdins-1416磷酸化(****P<0.0001)。免疫荧光实验证实，侧脑室连续注射rA2，增加了SVZ区DCX阳性面积比例(####P<0.0001)，增加了伤灶周围DCX/NeuN双染细胞数量(****P<0.0001)、BrdU/NeuN双染细胞数量(***p<0.001)、SGZ区DCX阳性细胞数量(###p<0.001)和海马BrdU/NeuN双染细胞数量(##p<0.01),而PDK1抑制剂OSU-03012腹腔注射削弱了rA2的这一作用。
结论
TBI后Annexin2在小鼠伤灶附近和伤侧SVZ中表达增加，并通过PDK1-Akt-Girdin信号通路促进SVZ和SGZ的神经前体细胞增殖并引导SVZ神经前体细胞向伤灶迁移，最终促进小鼠神经功能恢复。