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背景食管癌是世界范围内发病率和死亡率较高的恶性肿瘤之一,其发病率居世界肿瘤发病率第七位,是肿瘤相关死亡的重要原因之一。我国是食管癌高发地区,其发病率高于世界平均水平。尽管食管癌的诊疗水平不断提高,但因其早期症状不明显,发病较隐匿,很多患者在确诊时,疾病发展已处于中晚期,导致食管癌患者的5年生存率较低。探究食管癌发生及发展的潜在机制对临床诊断和治疗具有重要意义。食管癌的发生及发展是复杂的过程,在此过程中肿瘤微环境发挥着重要作用。肿瘤微环境由肿瘤细胞、免疫细胞、基质细胞以及各种细胞因子共同组成,其中免疫细胞的数量及功能状态,对肿瘤的发生发展起着重要作用。固有淋巴细胞(innate lymphoid cells,ILCs)是近年来新发现的一种固有免疫细胞。固有淋巴细胞是由造血淋巴样前体细胞(common lymphoid progenitor,CLP)分化而来,其表面没有抗原特异性受体,主要通过分泌细胞因子及其他机制发挥免疫细胞功能。根据细胞表型以及分泌细胞因子的不同,固有淋巴细胞可分为3个亚群,即ILC1、ILC2和ILC3。其中ILC2在白介素-33(Interleukin-33,IL-33)等细胞因子的作用下可分泌2型辅助性T细胞细胞因子,主要包括IL-4、IL-5、IL-9以及IL-13等细胞因子。在相关文献中,ILC2在抵抗寄生虫感染、自身免疫疾病等疾病中发挥着重要作用。尽管近年来有研究报道称在肿瘤组织中发现ILC2的浸润,然而ILC2在肿瘤进展中的作用尚不清楚。程序性死亡蛋白(programmed cell death protein-1,PD-1)作为一种重要的免疫检查点分子,主要表达于免疫细胞表面,PD-1通过与其配体PD-L1及PD-L2的结合抑制免疫细胞的功能。以往关于PD-1的研究报道主要集中在适应性免疫细胞,近年来,越来越多的研究表明,PD-1的表达可通过调控固有免疫细胞参与疾病的发生和发展。目前已证实ILC3中PD-1的表达与肿瘤远端转移有关,但关于ILC2中PD-1的表达与肿瘤的发生及发展的研究却鲜有报道。目前越来越多的研究提示,固有免疫细胞ILCs在肿瘤的发生及发展过程中发挥重要作用,但ILC2在食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)肿瘤微环境中的浸润程度及其PD-1表达水平的临床意义尚未揭示,本课题旨在探讨食管鳞癌肿瘤组织中ILC2的浸润程度、ILC2中PD-1的表达水平、ILC2的功能影响及PD-1~+ILC2与食管鳞癌临床参数的相关性,为揭示ILC2在肿瘤发生发展中发挥的作用,寻找新的临床指标提供理论依据。方法1.收集外周血(健康人15例及食管鳞癌患者44例)和肿瘤组织标本(食管鳞癌患者44例),分别经过密度梯度离心法和三酶消化法获得单细胞悬液,并利用流式细胞术检测ILCs中三个亚群细胞比例及其PD-1的表达水平;2.利用流式细胞仪分选食管鳞癌患者外周血及肿瘤组织中ILC2、PD-1~-ILC2和PD-1~+ILC2,通过流式细胞术检测ILC2表达IL-5和IL-13水平,利用酶联免疫吸附实验检测ILC2培养上清中IL-13水平;3.将ILC2或ILC2培养上清与食管鳞癌细胞系KYSE70共孵育,通过荧光素酶报告基因实验及流式细胞术检测ILC2对肿瘤细胞凋亡的影响,用ILC2培养上清及人重组蛋白IL-13处理KYSE70,通过细胞迁移实验,检测ILC2培养上清及重组蛋白IL-13对KYSE70迁移的影响。4.根据患者ILC2中PD-1的表达水平,将患者分为PD-1低表达组和PD-1高表达组,分析ILC2中PD-1的表达与食管鳞癌患者临床病理参数及预后的相关性。结果1.流式细胞术结果显示,同食管鳞癌患者外周血和健康人外周血相比,肿瘤组织中ILC2和PD-1~+ILC2的比例显著升高。2.流式细胞术及酶联免疫吸附实验结果一致表明,食管鳞癌肿瘤组织来源的ILC2中IL-13的表达水平显著高于外周血来源的ILC2;食管鳞癌肿瘤组织中PD-1~+ILC2细胞表达IL-13水平高于PD-1~-ILC2。3.流式细胞术及荧光素酶报告基因实验结果证实,ILC2及ILC2培养上清不影响KYSE70凋亡;进一步的迁移实验结果表明,ILC2培养上清及人重组蛋白IL-13促进KYSE70迁移。4.临床数据结果显示,ILC2中PD-1的表达与患者淋巴结转移及TNM分期相关,PD-1低表达组患者生存期长于PD-1高表达组患者生存期。结论与健康人外周血相比,食管鳞癌患者外周血及肿瘤组织中ILC2比例升高,且PD-1的表达促进ILC2分泌细胞因子IL-13,这进一步促进了食管鳞癌细胞的侵袭及转移。与之相对应的,临床数据分析结果证实,ILC2中PD-1的表达与食管鳞癌患者不良预后呈正相关。