论文部分内容阅读
DEHP是塑料工业最主要的改性添加剂,全球年产量达300-400万吨,广泛应用于各种塑料产品中。DEHP仅依靠分子间作用力而不是化学键与塑料主体基质结合,因此可不断地从塑料制品中游离出来,通过各种途径进入人体。DEHP对人的急性毒性较低,慢性毒性尚不明确,但大量的动物实验和一些流行病学研究提示DEHP及其代谢产物MEHP可对发育中及成年个体的多种组织系统包括肝、生殖系统、肾、肺及心脏等产生广泛的慢性毒性作用,并具有致畸性、致突变性和致癌性。由于目前的毒理学实验没有充分涵盖对受试物的神经毒性评价,而处于发育阶段的神经系统对毒物作用更为敏感,因此本文以PC12细胞作为神经元细胞模型,以C6细胞作为神经胶质细胞模型,研究DEHP、MEHP对神经细胞增殖、分化过程的影响,对DEHP的神经发育毒性作用进行初步评价。第一部分、DEHP、MEHP对未分化PC12细胞分化和增殖的影响目的：以未分化PC12细胞为模型,研究DEHP、MEHP对其增殖和分化过程的影响,从而评价其对神经元的发育毒性。方法：对未分化型PC12细胞进行培养；研究受试物的细胞增殖毒性时,向各组加入含有不同浓度(0.1～100mg/L)DEHP或MEHP的培养液,同时设立空白对照及0.1%DMSO的溶剂对照。对受试物细胞增殖毒性的评价方法包括：改良MTT法检测细胞生长曲线的影响、台盼蓝染料排斥法检测活细胞百分比、流式细胞术检测细胞周期以及流式细胞术和ELISA法检测细胞DNA合成水平。研究受试物对细胞分化的影响时,向各组加入含有50ng/mL鼠2.5S神经生长因子(NGF)及不同浓度(0.1～100mg/L) DEHP或MEHP的培养液,同时设立空白对照及0.1%DMSO的溶剂对照。评价受试物对细胞分化影响的方法包括：镜下观察细胞的形态学变化并测定突起细胞阳性比例、分级分离获取细胞膜蛋白和骨架蛋白并分别应用BCA法和Bradford法测定其含量、提取PC12细胞总RNA并以逆转录-荧光定量PCR测定细胞ChAT mRNA、TH mRNA和GAPDH mRNA水平。结果：在实验浓度范围内,DEHP、MEHP对末分化型PC12细胞均无细胞毒性；0.1～100mg/L DEHP对未分化型PC12细胞的活力、细胞周期中各期细胞比例及细胞的DNA合成水平均无影响；1.6～100mg/L MEHP降低未分化型PC12细胞的活力,且存在剂量效应关系(P<0.05); 0.1～100mg/L MEHP使细胞周期中S期细胞比例降低,G2期细胞比例升高,DNA合成水平下降,且存在剂量效应关系(P<0.05)。培养液中加入鼠2.5S神经生长因子诱导PC12细胞分化时,1～100mg／L的DEHP和10-100mg/L MEHP使分化中PC12细胞的膜蛋白、细胞骨架蛋白的含量增加,突起细胞阳性比例增加；以GAPDH mRNA为参照,实验浓度范围内的DEHP和MEHP对ChAT mRNA水平没有影响,对THmRNA水平起下调作用,且存在剂量效应关系(P<0.05)。结论：0.1～100mg/L的DEHP对未分化型PC12细胞的增殖没有影响,而低至0.1mg／L的MEHP即可对未分化型PC12细胞的增殖产生抑制作用。1～100mg/LDEHP和10～100mg/L MEHP均可促进NGF诱导的未分化型PC12细胞向胆碱能交感神经样细胞分化。第二部分、DEHP、MEHP对C6细胞分化和增殖的影响目的：以C6细胞为模型,研究DEHP及其代谢物MEHP对其增殖和分化过程的影响,从而评价其对神经胶质细胞的发育毒性。方法：对C6细胞进行培养；研究受试物的细胞增殖毒性时,方法同第一部分。研究受试物对细胞分化的影响时,向各组加入含有2mM丁酸钠及不同浓度(0.1～1 00mg/L) DEHP或MEHP的培养液,同时设立空白对照及0.1%DMSO的溶剂对照。评价受试物对细胞分化影响的方法包括：镜下观察细胞的形态学变化并测定延展细胞阳性比例、分离获取细胞骨架蛋白并以Bradford法测定其含量、提取C6细胞总RNA并以逆转录-荧光定量PCR测定细胞GFAP mRNA和GAPDH mRNA水平。结果：在实验浓度范围内,DEHP、MEHP对C6细胞均无细胞毒性；0.4mg/LDEHP可以使细胞生长曲线提高但对细胞周期和DNA合成水平无影响；1.6-100mg/L DEHP对C6细胞的活力没有影响；0.1～100mg/LDEHP对C6细胞的DNA合成水平和细胞周期中各期细胞比例均无影响；1.6-100mg/L MEHP抑制C6细胞的活性,且存在剂量效应关系(P<0.05); 0.1～100mg/L MEHP使细胞周期中S期细胞比例降低,G2期细胞比例升高,DNA合成水平下降,且存在剂量效应关系(P<0.05)。培养液中加入丁酸钠诱导C6细胞分化时,1-100mg／L的DEHP和10-100mg/L MEHP使分化中C6细胞的细胞骨架蛋白含量增加,延展细胞阳性比例升高(P<0.05)；以GAPDH mRNA为参照,1～100mg／L的DEHP和MEHP上调GFAP mRNA水平,且存在剂量效应关系(P<0.05)。结论：0.1～100mg／L的DEHP对C6细胞的增殖没有影响,而低至0.1mg／L的MEHP即可对C6细胞的增殖产生抑制作用。1～100mg/L DEHP和MEHP均可促进丁酸钠诱导的C6细胞分化。