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目的:聚乙二醇化修饰(PEGylation)是广泛应用于改善蛋白类药物的药代动力学和药效学的一种方法。以往的PEG修饰方法所得到蛋白的均一性差，因此缺乏商业吸引力。为了弥补现有液相和固相PEG修饰工艺的不足，从而完善固相PEG修饰工艺体系，我们建立了一种以疏水性层析色谱柱为反应载体的新型蛋白固相聚乙二醇修饰工艺。 方法:针对不同蛋白的疏水特性，在疏水性层析色谱柱上采用两种不同的固相聚乙二醇(PEGylation)修饰工艺。针对疏水性强的蛋白，采用方法1:即在高盐状态下将蛋白（如溶菌酶）吸附于疏水层析柱上，以mPEG20kDa-丁醛反应液作为流动相，反应完成后采用盐离子梯度洗脱获得PEG修饰蛋白产物;针对疏水性弱的蛋白，采用方法2:即高盐状态下将mPEG20kDa-丁醛吸附于疏水层析柱后，以蛋白（重组人成纤维细胞生长因子-1，rhFGF-1）溶液作为流过相，反应完成后采用低盐缓冲液洗脱获得PEG修饰蛋白产物。对分离纯化后的修饰蛋白，我们采用SDS-PAGE和RP-HPLC进行了鉴定。此外，我们通过MALDI-TOF-MS飞行质谱检测修饰蛋白的分子量，并以此确定蛋白的PEG修饰程度;CD圆二色谱检测PEG修饰对蛋白的二级结构有无影响;采用MTT细胞实验(NIH3T3细胞)检测PEG修饰是否影响rhFGF-1本身促细胞增殖的能力;采用菌体消化实验（融壁微球菌）检测PEG修饰是否影响LYS本身消化细菌的能力。 结果:在HiTrap Butyl FF（丁基）;HiTrap Octyl Fast Flow（辛基）;HiTrap phaseFF（苯基）此类疏水色谱柱上进行溶菌酶固相PEG修饰的最佳条件是:选用基质疏水性最强的苯基柱;先将PB缓冲液(20mM，pH6.0，2M NaCl)配制的溶菌酶溶液挂柱，然后以含有30mM氰基硼氢化钠的PB缓冲液(20mM，pH6.0，2M NaCl)配制的聚乙二醇-丁醛(20kDa)溶液作为流动相，锡箔纸包裹避光并维持室温。反应结束后立刻用无盐PB缓冲液（20raM，pH6.0）洗脱，修饰产物经阳离子交换层析色谱柱（CM-SepHarose柱）分离纯化得到。疏水色谱柱上进行rhFGF-1的固相PEG修饰的最佳条件是:选用基质疏水性最强的苯基柱;先将PB缓冲液(20mM，pH6.0，3M NaCl)配制的聚乙二醇-丁醛(20kDa)溶液挂柱，然后以含有30mM氰基硼氢化钠的PB缓冲液(20mM，pH6.0，3M NaCl)配制rhFGF-1溶液作为流动相，锡箔纸包裹避光并维持室温。最后用无盐PB缓冲液(20mM，pH6.0)洗脱疏水色谱柱，收集洗脱峰，无需进一步分离纯化。MALDI-TOF质谱的结果显示PEG-Lys的分子量为35.6kDa，PEG-rhFGF1的分子量为36.6 kDa，提示只有一个PEG分子修饰到蛋白表面;CD结果显示PEG-Lys; PEG-rhFGF-1与野生蛋白的紫外吸收趋势相同，表明PEG修饰过程对蛋白的空间结构基本上无影响。活性数据显示，疏水柱固相修饰反应得PEG-rhFGF-1的活性与野生型rhFGF-1无明显差别，且活性高于液相条件下修饰得到的PEG-rhFGF-1;溶菌酶的修饰产物无论是在固相还是液相修饰条件下的活性均相当于野生型溶菌酶的7％。 结论:本文提供了一种以疏水性层析色谱柱为反应载体的新型蛋白固相聚乙二醇修饰工艺。针对不同蛋白的疏水特性，提出两种疏水柱上固相聚乙二醇(PEG)修饰工艺。针对疏水性强的蛋白，采用方法1，即在高盐状态下将蛋白吸附于疏水层析柱上，以PEG修饰剂为流动相，反应完成后采用盐离子梯度洗脱获得PEG修饰蛋白;针对疏水性弱的蛋白，采用方法2，即高盐状态下将PEG吸附于疏水层析柱后，以蛋白溶液作为流动相，反应完成后采用低盐缓冲液洗脱获得PEG修饰蛋白。上述两种工艺所得修饰产物为特异性定点修饰且活性保持率好、体内长效特征明显。