黄连解毒汤为清热解毒代表方剂,处方载于《肘后备急方》,名称始见于《外台秘要》。本方由黄连,黄芩,黄柏,栀子4味中药组成,按照3:2:2:3比例进行配伍,具有泻火解毒之功效,主治一切实热火毒,三焦热盛之证。黄连解毒汤治疗炎症的临床疗效明确。炎症在中医理论中对应实火或热毒的概念。黄连解毒汤作为清热解毒的代表方,可以改善炎症反应引发的红肿热痛。外邪化热成毒,损伤脑络,黄连解毒汤对中枢神经炎症也有相应的改善作用。但目前的研究多聚焦于黄连解毒汤的抗炎活性评价上,关于其清热解毒的生物学表征及作用机制尚有待进一步阐明。炎症反应与脂质代谢紊乱密切相关。细胞膜中甘油磷脂、鞘脂、甘油脂等脂质含量的比例变化是炎症反应的重要表征。多元不饱和脂肪酸与其代谢产物(过氧化脂质)的变化在炎症促进和消退过程中的重要作用也受到了广泛的重视。脂质代谢紊乱会加速炎症变性进程。炎症反应会加重脂质代谢失衡,导致脂质代谢紊乱。黄连解毒汤可通过提高脂代谢酶的活性,改善机体的脂质水平,有效调控脂质代谢稳态。因此,对脂质代谢紊乱的调控可能为黄连解毒汤清热解毒方药改善炎症反应的重要靶标。本论文从LPS诱导的斑马鱼炎症反应,进而深入聚焦到高脂叠加APP/PS1小鼠中枢神经炎症两个层面,来具体探讨研究黄连解毒汤基于脂代谢的调节改善炎症的作用机制。一、黄连解毒汤及其主要成分改善LPS诱导斑马鱼炎症的研究采用荧光标记转基因中性粒细胞斑马鱼,卵黄囊部位注射LPS建立斑马鱼炎症模型。以卵黄囊部位的中性粒细胞个数作为药效学评价的指标。结果表明,与正常对照组相比,LPS刺激后,斑马鱼中性粒细胞个数显著增加。黄连解毒汤及小檗碱,黄芩苷与京尼平苷三个主要成分给药后,均有明显的抗炎活性。其中,黄连解毒汤的抗炎效果更为突出。通过实时定量RT-PCR方法对斑马鱼TLR4/MyD88通路中的6个主要激酶蛋白及5个炎症因子的mRNA表达进行检测。结果表明,与正常对照组相比,所检测的指标在LPS组中均有显著性变化(P<0.001),黄连解毒汤及三个单体在给药后,与LPS组相比,该通路上所检测的指标均有不同程度恢复至正常水平的趋势。激酶蛋白与炎症因子的相关性分析结果提示,黄连解毒汤主要通过调控上游MyD88接头分子改善炎症因子的表达。小檗碱与NF-κB及MAPK下游的ERK通路表现出强相关。黄芩苷、京尼平苷与MAPK通路表现出强相关。基于UPLC-Q Exactive-MS/MS技术对所检测的斑马鱼样本进行非靶向与靶向脂质组学检测,将所得数据进行主成分分析与正交偏最小二乘法-判别分析,挑选出VIP>1及P<0.05的差异性脂质代谢物,探讨黄连解毒汤复方基于脂代谢调节改善LPS诱导斑马鱼炎症的作用机制。结果表明,筛选出的潜在脂质标志物主要集中于PC,PE,SM与TG四类。进而聚焦到脂质库中包含的这些脂类做靶向半定量分析。与正常对照组相比,模型组中共有25个脂质标志物具有显著性变化,且脂质之间均表现出密切的强相关作用。基于KEGG数据库的代谢组学途径分析表明,黄连解毒汤主要是通过甘油磷脂代谢途径对脂代谢紊乱进行调节。通过构建黄连解毒汤发挥抗炎作用的“潜在脂质标志物-TLR4/MyD88信号通路”的可视化网络关联性分析发现,与脂质标志物密切相关的脂蛋白如PLA2、SGMS与SMDP等在介于脂质代谢稳态和TLR4/MyD88信号通路之间发挥重要的连接作用,维持脂代谢稳态平衡是黄连解毒汤发挥抗炎作用的重要作用机制之一。二、黄连解毒汤改善高脂叠加APP/PS1小鼠中枢神经炎症的研究通过实时定量RT-PCR方法对小鼠脑组织中炎症因子TNF-α,IL-1β的mRNA水平进行检测。结果表明,与正常对照组相比,在高脂叠加AD小鼠中,TNF-α,IL-1β含量呈显著性升高的趋势。低、高剂量黄连解毒汤可呈剂量依赖性降低炎症因子的mRNA水平,且在高剂量黄连解毒汤组中具有显著性差异。利用UPLC-AB Sciex Triple Quad6500+液质联用技术建立了 25个(18个绝对定量,7个相对定量)神经递质的检测方法并进行了含量测定。结果表明,所建立的UPLC-MS/MS方法基本适用于大批量生物样本中的神经递质的含量测定。与正常对照组相比,有14个指标在高脂叠加AD组中有显著性变化。黄连解毒汤给药后,有5个指标表现出显著性回调趋势。其中赖氨酸与精氨酸呈剂量依赖性改善。通过通路富集分析发现,黄连解毒汤主要可改善氨基酸代谢这一途径。对兴奋性氨基酸、抑制性氨基酸、胆碱能系统等有一定的改善作用,部分神经递质表现出显著性差异。基于以上药效学评价的结果,进而围绕着与脂代谢相关的内源性物质的变化,来深入探讨黄连解毒汤改善高脂叠加APP/PS1小鼠中枢神经炎症的作用机制。基于细胞膜上脂质的变化,采用UPLC-QQQ-MS/MS液质联用的方法重点围绕着小鼠脑组织中磷脂与鞘脂等进行了半定量靶向脂质研究,阐明黄连解毒汤对脂质含量构成比的调控作用。结果表明,与正常对照组相比,有26个脂质在高脂叠加AD组中有显著性变化。其中有14个脂质在黄连解毒汤给药后有回调趋势。PC(20:5/22:6),PE(O-18:1/22:6)与PE(16:0/20:4)的表达在给药后具有显著性差异。采用Western Blot的方法对多元不饱和脂肪酸通路中的环氧合酶,脂氧合酶,细胞色素P450酶的表达进行了半定量检测。结果表明,与正常对照组相比,5-LOX酶的表达在高脂叠加AD组中显著性降低。低、高剂量黄连解毒汤给药后,COX-2,5-LOX与12-LOX酶的含量呈剂量依赖性降低趋势。其中,高剂量黄连解毒汤可显著降低COX-2,5-LOX酶的含量。利用UPLC-AB Sciex Triple Quad 6500+液质联用技术分别建立了 4个多元不饱和脂肪酸与19个过氧化脂质的检测方法,并进行了样品中的含量测定。结果表明,所建立的UPLC-MS/MS测定方法经方法学系统验证准确、灵敏、可靠,基本适用于大批量生物样本中的含量测定。与正常对照组相比,在高脂叠加AD组中,PGs,TXs含量显著性升高;EETs,DiHETs等成分的含量显著性下降。低、高剂量黄连解毒汤给药后所检测的指标有一定的回调趋势,且在高剂量黄连解毒汤组中多具有显著性改变。其中,EETs在黄连解毒汤给药后的表达呈剂量依赖性升高的趋势。综上所述,黄连解毒汤及其主要成分可显著缓解LPS诱导的斑马鱼炎症,基于脂质及其相关脂蛋白的调节是黄连解毒汤发挥抗炎作用的重要途径之一。黄连解毒汤还可通过调节多元不饱和脂肪酸通路中的特定酶及其代谢产物过氧化脂质等脂代谢相关的表达,从多层面改善高脂叠加APP/PS1小鼠中枢神经炎症。本实验基本阐明了黄连解毒汤可通过对脂代谢(脂质、多元不饱和脂肪酸通路的特定酶,过氧化脂质)多环节的调控整体改善炎症微环境紊乱的作用机制。立足临床,应用中医药理论,为进一步丰富和完善中药清热解毒方剂对炎症以及“毒损脑络”诱发的中枢神经炎症的病机提供了研究理论和实验基础。以期中医药能够在临床多学科中得到进一步更好的应用。