本文的研究目的是观察TNFα信号通路主要受体衔接蛋白在SLE患者外周血及肾脏组织的表达变化，探讨其在SLE发病机制中的作用，为制定更有效的TNFα调节策略提供依据和治疗靶点。 第一章 TNFα信号通路主要受体衔接蛋白在SLE患者外周血单个核细胞中的表达变化及其临床意义 目的：探讨TNFα信号通路主要受体衔接蛋白在SLE患者外周血单个核细胞中的表达变化及其临床意义。 方法：收集中山大学附属第一医院确诊的SLE住院患者和健康志愿者外周静脉血，分离血浆和PBMCs，采用酶联免疫吸附试验检测血浆中TNFα水平，采用半定量RT—PCR和实时荧光定量PCR检测TNFα，TNFR1、TNFR2和上述四种受体衔接蛋白及Caspase3和白介素-1β的mRNA表达水平，比较SLE患者与健康志愿者之间以及不同狼疮活动度SLE患者中上述四种受体衔接蛋白的表达差异，以及与狼疮活动指数之间的相关关系。SLE活动性评估依据SLEDA1评分标准进行。 结果：SLE患者血浆中TNFα的水平明显高于正常对照者的水平。SLE患者PBMCs中Caspase3mRNA的表达明显升高，而IL-1βmRNA的表达与正常对照组之间无统计学差异。SLE患者PBMCs中TRADD、FADD、RIP和TRAF—2mRNA的表达与狼疮活动指数均呈负相关关系，相关系数分别为—0.285，—0.280，—0.307和—0.298. 小结：TNFα信号通路中主要的四种受体衔接蛋白TRADD、FADD、RIP和TRAF—2mRNA在SLE患者PBMCs中的表达均降低，且与狼疮活动指数呈负相关关系，其异常表达可能参与了TNFα信号网络紊乱所介导的SLE免疫病理损伤。 第二章 TNFα信号通路主要受体衔接蛋白在SLE患者外周血不同淋巴细胞亚群中的表达变化及其临床意义 目的：探讨TNFα信号通路TNFRs以及主要受体衔接蛋白—TRADD、RIP和TRAF—2在SLE患者外周血不同淋巴细胞亚群中的表达变化及其临床意义。 方法：收集加拿大多伦多大学附属西区医院确诊的SLE住院患者和健康志愿者外周静脉血，采用实时荧光定量PCR检测外周静脉全血中TNFα、TNFRs和受体衔接蛋白TRADD、RIP和TRAF—2mRNA的表达水平。分离出血清和PBMCs，采用ELISA检测血清中TNFα的水平，采用特异性CD分子抗体标记淋巴细胞亚群，多通道流式细胞术检测TNFRs和上述三种主要受体衔接蛋白及活化的Caspase3表达水平，分析比较这些信号分子在SLE患者与健康志愿者之间不同淋巴细胞亚群中的表达差异，以及与狼疮活动指数之间的相关关系。SLE活动性评估依据SLEDAI评分标准进行。 结果：SLE患者血清中TNFα的水平显著高于正常对照者的水平。SLE患者外周静脉全血中TNFα、TNFRs以及受体衔接蛋白TRADD、RIP和TRAF—2mRNA的表达与正常对照者之间的差别无统计学意义。与健康对照组相比，SLE患者CD4+T淋巴细胞和CD19+B淋巴细胞比例显著降低，而CD8+T淋巴细胞和CD14+CD64+细胞比例显著升高。SLE患者TNFR1+细胞的比例在CD4+和CD8+T淋巴细胞以及成熟单核细胞中与正常对照组无显著差别，但在CD19+B淋巴细胞中显著高于正常对照组。SLE患者TNFR2+细胞的比例在CD4+T淋巴细胞和CD19+B淋巴细胞中显著高于正常对照组，但在CD8+T淋巴细胞以及成熟单核细胞中与正常对照组无显著差别。SLE患者和正常对照组间所有已分析的细胞亚群中TRADD+细胞的比例无显著差别。SLE患者RIP+细胞的比例在CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞和CD19+B淋巴细胞中显著低于正常对照组，但在成熟单核细胞中的比例与正常对照组没有明显差别。SLE患者TRAF—2+细胞的比例在CD4+T淋巴细胞和CD19+B淋巴细胞中显著高于正常对照组，但在CD8+T淋巴细胞以及成熟单核细胞中与正常对照组比较无显著差别。SLE患者活化的Caspase3+细胞的比例在CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、CD19+B淋巴细胞和成熟单核细胞中均显著高于正常对照组。SLE患者血清TNFα水平与外周血淋巴细胞亚群中TNFRs、受体衔接蛋白TRADD、RIP和TRAF—2的表达无明显相关关系，也与狼疮病变活动度SLEDAI无明显相关关系。SLE患者CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞和成熟单核细胞中TNFR1+细胞的比例与狼疮病变活动度SLEDAI呈明显负相关关系。SLE患者CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞中TNFR2+细胞的比例与狼疮病变活动度SLEDAI呈明显负相关关系。SLE患者不同淋巴细胞亚群中受体衔接蛋白TRADD、RIP和TRAF—2阳性细胞的比例与狼疮病变活动度SLEDAI无明显相关关系。 小结：SLE患者血清中TNFα的水平显著升高。SLE患者CD19+B淋巴细胞中TNFR1+细胞的比例显著上升，CD4+T淋巴细胞和CD19+B淋巴细胞中TNFR2+细胞和TRAF—2+细胞的比例显著上升。虽然在第一章的研究中显示SLE患者PBMCs中TNFR2和TRAF—2mRNA水平表达低下，但本部分研究显示CD4+T淋巴细胞和CD19+B淋巴细胞中TNFR2和TRAF—2的表达显著上升，其差异机制可能与研究mRNA水平和蛋白水平之间存在差异有关。 第三章 TNFα信号通路主要受体衔接蛋白在狼疮肾炎患者肾组织中的表达变化及其在SLE器官炎症性病变中的作用 目的：探讨TNFα信号通路主要受体衔接蛋白TRADD、RIP和TRAF—2在狼疮肾炎患者肾脏活检组织中的表达变化及其在SLE器官炎症性病变中的作用。 方法：收集LN患者肾脏活检组织标本，以肾脏肿瘤切除术中远离肿瘤部位的正常肾组织为对照。肾脏组织石蜡切片，常规脱蜡至水，采用免疫组化染色方法检测TNFα、TRADD、RIP和TRAF—2的表达。同时检测反映细胞增殖状态的标志蛋白增殖细胞核抗原以及反映炎症细胞浸润情况的单核—巨噬细胞标志蛋白CD68的表达。分析TNFα、受体衔接蛋白TRADD、RIP和TRAF—2的表达与PCNA阳性细胞数和CD68阳性细胞数以及肾脏病理改变之间的相关性。 结果：19例LN患者肾组织标本及4例正常肾组织标本免疫组化研究结果显示：正常肾组织中未发现TNFα表达阳性信号，而在壁层上皮细胞、系膜细胞、内皮细胞、远端和近端肾小管中可见TRADD、RIP和TRAF—2少量表达。TNFα、TRADD、RIP和TRAF—2的表达增强与PCNA阳性细胞数和CD68阳性细胞数的增多以及肾脏病变活动度的增加显著正相关。 小结：TNFα和TNFα信号通路主要受体衔接蛋白在LN患者肾活检组织中的异常表达可能通过介导异常细胞增生和促炎症信号参与LN局部组织器官的免疫病理损伤。 第四章 TRAF—2在免疫复合物诱导大鼠肾小球系膜细胞分泌炎症因子及细胞增殖中的作用 目的：探讨TNFα信号通路受体衔接蛋白TRAF—2在免疫复合物诱导大鼠肾小球系膜细胞分泌炎症因子及细胞增殖中的作用。 方法：以聚合IgG,一种标准的免疫复合物模型刺激体外培养的大鼠肾小球系膜细胞株。依据设计小于扰RNA的原则，以TRAF—2为靶基因设计并合成siRNA。实验分对照组、无siRNA转染+AIgG刺激组、对照siRNA转染+AlgG刺激组、TRAF—2 siRNA转染+AIgG刺激组。RT—PCR和Western blot法观察大鼠肾小球系膜细胞中TRAF—2、IL-1β、IL—6表达改变，MTT法检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞周期的变化，Annexin V检测凋亡细胞的改变。 结果：可溶性AIgG可呈时间梯度和浓度梯度依赖性刺激大鼠肾小球系膜细胞上调表达IL-1β和IL—6，并刺激细胞增殖。可溶性AIgG可刺激大鼠肾小球系膜细胞上调表达TRAF—2。TRAF—2 siRNA转染可抑制可溶性AIgG所诱导的TRAF—2的上调表达，并可抑制可溶性AIgG刺激所引起的IL-1β和IL—6的上调表达。TRAF—2 siRNA可将细胞阻滞在G1期，阻止细胞进入S期，并促进细胞凋亡。 小结：可溶性AIgG对大鼠肾小球系膜细胞具有时间梯度和浓度梯度依赖的促炎症因子分泌和促细胞增殖作用。TRAF—2参与了可溶性AlgG诱导的大鼠肾小球系膜细胞的促炎症因子分泌和促细胞增殖作用。特异性地阻断TRAF—2可显著抑制可溶性AIgG诱导的大鼠肾小球系膜细胞的促炎症因子分泌和促细胞增殖作用。在特定的组织器官中应用siRNA阻断TRAF—2可能是一种有效、高特异性且低毒性的治疗LN的方法。 结论： TNFα信号通路中主要的受体衔接蛋白TRADD、RIP和TRAF—2在SLE患者PBMCs、不同淋巴细胞亚群以及肾脏组织中的异常表达参与了TNFα信号网络紊乱所介导的SLE全身及局部组织器官的免疫病理损伤。TRAF—2在AIgG诱导的大鼠肾小球系膜细胞的促炎症因子分泌和促细胞增殖作用中具有重要作用。特异性地阻断TRAF—2可显著抑制可溶性AIgG诱导的大鼠肾小球系膜细胞的促炎症因子分泌和促细胞增殖作用。上述研究为阐明SLE发病机制及临床制定更有效的TNFα调节策略提供了理论依据和治疗靶点。