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流行性感冒,简称流感,是由流感病毒引起的疾病。根据世界卫生组织报道,在每个流行季节,大约有5%~15%的人会罹患流感。目前公认的预防流感最有效和最经济的的手段为疫苗接种,而其中应用最为广泛的为流感病毒裂解疫苗,包含H1N1、H3N2两株甲型毒株和一株乙型毒株。由于流感病毒容易发生变异,因此,流感疫苗需要根据流行情况更换生产用毒株,相应的,人群也需要每年免疫。但在大流行流感发生时,生产用毒株的制备及参考品研制等过程会导致疫苗不能及时上市,难以在病毒流行初期为人群提供有效的保护。此外,在流感疫苗的评价中也存在某些空白。在流感病毒囊膜表面存在两种糖蛋白,分别为血凝素(HA)与神经氨酸酶(NA),针对这两种蛋白的抗体均能够对机体起到保护作用,而其中HA的作用更为显著,因此目前流感病毒裂解疫苗有效成分的衡量指标为HA含量,通过单向免疫扩散试验(SRID)进行检测。但对于NA抗原,目前仅能通过检测其活性来证明其存在,缺少有效的定量检测方法,也没有普遍可接受的标准,是制约流感疫苗质量评价的瓶颈之一。鉴于上述原因,流感病毒通用抗体的研制成为了近年来的研究热点。一方面,研制能够对抗多种亚型流感病毒的通用抗体,可以在第一时间为人体提供保护,是防控新发流感疫情的重要手段。另外,通用抗体可用于现有流感疫苗或基于新毒株的流感疫苗的质控,从而全面评价疫苗的质量。本研究采用与以往不同的策略制备流感病毒通用抗体,即首先通过生物信息学分析手段,筛选几乎所有流感病毒HA和NA氨基酸序列中的极端保守序列作为靶位,合成多肽免疫动物制备了HA和NA单克隆通用抗体。HA和NA单克隆通用抗体均能在体外结合多亚型的流感病毒,并在小鼠流感病毒攻击保护模型中有保护作用,提示通用抗体在流感治疗中的潜在应用。此外,考虑到在流感疫苗中有三个NA亚型,本研究又进一步对各NA亚型进行分析,筛选各亚型内保守但型间特异的多肽序列,从而制备了NA亚型通用性抗体,这些抗体能够结合同亚型内不同毒株,并与其它亚型的毒株无交叉反应,从而成功建立了可对流感病毒裂解疫苗中三种NA亚型分别定量的检测方法。1 HA和NA通用抗体制备与鉴定根据前期生物信息学分析结果,分别合成HA保守肽段Uni1和NA的保守肽段HCA2,并与载体蛋白偶联,免疫小鼠制备了单克隆抗体。获得6株针对HA的Uni1位点的单克隆抗体,对抗体进行了可变区测序和亚型鉴别。所有6株单抗均能在ELISA实验中与不同亚型流感病毒结合。在免疫印迹实验中,其中五株单抗能够与H1N1、H3N2和H7N9进行结合,而另一株单抗不仅能够结合以上三株甲型流感病毒HA,还与B型流感病毒的HA能够结合,显示出更为广谱的结合效果。获得13株针对NA的HCA2单克隆抗体,4株ELISA效价最高的HCA2单克隆抗体均能与不同亚型流感病毒结合。通过噬斑中和实验考察了抗体对病毒的中和作用,发现Uni1-1株单抗能够使噬斑变小并且数量减少,提示该抗体具有中和活性,并通过细胞膜融合抑制实验探讨了该通用抗体抑制病毒繁殖的作用机制。2 HA和NA通用抗体对小鼠的保护作用采用小鼠感染模型,对6株HA单克隆抗体的保护效果进行了检测,结果证明对PR8病毒攻击的小鼠均有保护,但效果有差异。Uni1-1抗体保护效果最好,在50mg/kg剂量给药后,以5倍LD50剂量PR8病毒攻击后60~80%的小鼠存活,而相同剂量下Uni1-5仅有10%的保护率。以NA单克隆抗体进行检测,四株单抗的保护效果低于Uni1-1抗体。其中,保护率最高的为HCA2-2单抗,在100mg/kg剂量时能够保护67%的小鼠,与Uni1-1剂量为50mg/kg时保护率相当。同样剂量时,HCA2-3和HCA2-8保护率为33%,而HCA2-7单抗无保护。对Uni1-1株单抗进行了多型别流感病毒的攻毒保护实验,以验证其通用性。使用的病毒包括H1N1和H3N2,以及H5N1和H7N9共四株病毒。其中,在100mg/kg剂量给药时,Uni1-1单抗对H1N1病毒保护率为100%,攻毒后第三天,实验组小鼠肺部流感病毒滴度为对照组的1%;对H5N1流感病毒的保护率为50%,实验组肺部病毒滴度为对照组的7%;对H3N2流感病毒的保护效果为70%,实验组肺部病毒滴度为对照组的4%;对H7N9流感病毒的保护率为60%,实验组肺部病毒滴度为对照组的7%。此外,对实验组及对照组小鼠体重变化情况进行了比较。以上结果表明,Uni1-1单抗在体内对多种亚型的流感病毒具有广谱保护作用,能显著降低肺部流感病毒滴度,提高小鼠的生存率。3 NA亚型通用抗体的制备与应用通过生物信息学分析,筛选NA亚型内保守但型间特异的多肽序列,从而制备了流感疫苗中三种NA亚型的通用抗体。使用N1~N9和B型流感病毒对制备的抗体进行了特异性验证,证实三抗体仅与对应亚型的NA反应,与其他亚型的NA无交叉反应。本研究还制备了H1N1、H3N2、B型流感病毒NA含量检测标准品,优化实验条件建立了检测三价流感疫苗中NA含量的Slot-Blot方法,并对多个企业的流感疫苗进行了检测。结果表明不同来源的疫苗中同亚型NA含量差异较大,例如N1含量最高为6080ng/mL,最低为145ng/mL;同一企业不同亚型的疫苗NA含量也有很大差异,N1含量最高,B型普遍较低。综上所述,本研究成功制备了HA和NA单克隆通用抗体和NA亚型通用抗体,以体外方法证明其广谱中和作用并初步探讨了作用机制;在小鼠中证明了对病毒攻击的广谱保护作用;并以NA亚型通用抗体建立了检测方法,填补了流感疫苗质控中的一项空白。