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第一部分目的:观察杜仲叶提取物山奈酚(Kae)对卵巢去势大鼠骨髓间充质干细胞诱导成骨的影响。方法:首先,按照常规建立卵巢去势大鼠模型及获取普通健康雌性SD大鼠,常规饲养8周,引颈处死大鼠后取后肢,无菌操作下从股骨和胫骨中冲洗出骨髓间充质干细胞(BMSCs),按照常规方法予以进行体外培养,传至第3代后将其分为三组:正常对照组(Control)、骨质疏松模型组(OVX)和山奈酚干预组(OVX+Kae)。Control组使用未行过卵巢去势手术的大鼠骨髓间充质干细胞,在体外诱导成骨;OVX组使用卵巢去势模型大鼠骨髓间充质干细胞,体外诱导成骨;OVX+Kae组是在OVX组的基础上添加Kae对骨髓间充质干细胞进行药物干预。MTT法检测Kae的细胞毒性,茜素红染色观察诱导成骨的情况,并检测诱导成骨后的细胞中碱性磷酸酶(ALP)的活力水平。同时使用实时定量PCR(qPCR)法检测各组细胞中Runx2和Osterix的mRNA相对转录水平以及通过蛋白质免疫印记法(WB)检测各组细胞中Runx2和Osterix蛋白表达水平。结果:1、不同干预浓度山奈酚对大鼠骨髓间充质干细胞均有不同程度的细胞毒性,且具有明显的剂量依赖性,在山奈酚干预浓度为100μM时细胞毒性达到最大值。2、茜素红染色结果显示,当山奈酚干预浓度为10μM时诱导成骨情况最佳。3、山奈酚能够显著增加卵巢去势大鼠骨髓间充质干细胞诱导成骨过程中ALP的活力水平。4、山奈酚能够显著上调各组细胞中Runx2和Osterix的mRNA的相对转录水平。5、山奈酚能够显著上调各组细胞中Runx2和Osterix的蛋白表达水平。结论:1、山奈酚能够促进卵巢去势大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,改善骨代谢;2、山奈酚改善骨代谢的作用机制可能与其能够调控Runx-2和Osterix的基因或蛋白表达水平有关。第二部分目的:探讨山奈酚促进卵巢去势大鼠骨髓间充质干细胞诱导成骨的作用机制与mTOR信号通路的关系。方法:首先,建立卵巢去势大鼠模型,常规饲养8周后处死,在无菌操作下取大鼠后肢,从股骨和胫骨中冲洗出骨髓间充质干细胞,予以进行体外培养,将骨髓间充质干细胞传代至第3代后将其分为五组,:正常对照组(control)、骨质疏松模型组(OVX)、山奈酚干预组(OVX+Kae)、山奈酚和雷帕霉素联合干预组(OVX+Kae+Rapa)和雷帕霉素干预组(OVX+Rapa)。Control组使用未行过卵巢去势手术的大鼠骨髓间充质干细胞,在体外诱导成骨;OVX组使用卵巢去势模型大鼠骨髓间充质干细胞,体外诱导成骨;OVX+Kae组是在OVX组的基础上使用Kae对骨髓间充质干细胞进行药物干预;OVX+Kae+Rapa组是在OVX+Kae组的基础上使用Rapa对骨髓间充质干细胞进行药物干预;OVX+Rapa组是在OVX组基础上使用Rapa对骨髓间充质干细胞进行药物干预。使用茜素红染色观察诱导成骨的情况,并检测诱导成骨后细胞中碱性磷酸酶(ALP)的活力水平。qPCR法检测各组细胞中Runx2、Osterix、4E/BP1和S6K1的mRNA的相对转录水平;蛋白质印记法检测各组细胞中Runx2、Osterix、4E/BP1、p-4E/BP1、S6K1和p-S6K1蛋白表达水平。结果:1、山奈酚对骨髓间充质干细胞进行干预后,细胞钙结节数量显著增加(p<0.05 vs.OVX),而OVX+Kae+Rapa组和OVX+Rapa组细胞钙结节数量显著降低(p<0.05vs.OVX+Kae)。2、山奈酚进行干预后,细胞ALP活力水平显著增加(p<0.05 vs.OVX),而OVX+Kae+Rapa组和OVX+Rapa组细胞ALP活力水平显著降低(p<0.05 vs.OVX+Kae)。3、山奈酚干预能够显者著上调细胞中Runx2和Osterix的mRNA相对转录水平(p<0.05 vs.OVX),而OVX+Kae+Rapa组和OVX+Rapa组细胞中Runx2和Osterix的mRNA相对转录水平显著降低(p<0.05 vs.OVX+Kae)。4、山奈酚干预能够显著下调细胞中4E/BP1mRNA相对转录水平,并显著上调S6K1 的mRNA相对转录水平(p<0.05 vs.OVX),而OVX+Kae+Rapa组和OVX+Rapa组细胞中4E/BP1和S6K1的mRNA相对转录水平均出现相反趋势(p<0.05vs.OVX+Kae)。5、山奈酚干预能够显著上调细胞中Runx2和Osterix的蛋白表达水平(p<0.05 vs.OVX),而OVX+Kae+Rapa组和 OVX+Rapa组细胞中 Runx2和Osterix的蛋白表达水平显著降低(p<0.05 vs.OVX+Kae)。6、山奈酚干预能够显著下调细胞中p-4E/BP1蛋白表达水平,并上调p-S6K1蛋白表达水平(p<0.05 vs.OVX),而OVX+Kae+Rapa组和OVX+Rapa组细胞中4E/BP1和S6K1的蛋白表达水平均出现相反趋势(p<0.05vs.OVX+Kae)。结论:山奈酚促进卵巢去势大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的作用机制可能与其能够调控mTOR-RUNX2/Osterix信号通路有关。第三部分目的:在动物整体水平,观察山奈酚对卵巢去势大鼠骨代谢的影响,并探讨其作用机制与mTOR信号通路的关系。方法:将30只雌性SD大鼠随机分为5组:假手术组(Sham)、卵巢去势模型组(OVX)、山奈酚治疗组(OVX+Kae)、山奈酚与雷帕霉素联合干预组(OVX+Kae+Rapa)和雷帕霉素干预组(OVX+Rapa)。Sham组大鼠不进行卵巢摘除,常规饲养;OVX组大鼠行卵巢摘除手术,常规饲养8周;OVX+Kae组在OVX组基础上,予以大鼠100mg/kg/d剂量的山奈酚灌胃给药,连续给药8周;OVX+Kae+Rapa组在OVX+Kae组基础上予以0.2mg/kg/d雷帕霉素腹腔注射给药,均持续给药8周。OVX+Rapa组在OVX组基础上,予以0.2mg/kg/d雷帕霉素腹腔注射给药,均持续给药8周。各组大鼠在第8周被处死,取股骨后使用Micro-CT进行扫描。结果:1、山奈酚能够改善OVX所致大鼠股骨干骺端骨小梁数量显著减少和骨小梁厚度变薄,而经过雷帕霉素干预的大鼠,山奈酚对骨保护的积极作用被逆转。2、山奈酚能够显著改善OVX大鼠的BV/TV、SMI、Tb.N、Tb.Th、BMD等各项骨形态学参数,而在OVX+Kae+Rapa组和OVX+Kae组,山奈酚对骨形成的积极影响均被显著逆转。结论:1、山奈酚能够改善卵巢去势大鼠骨密度和骨形态学参数,促进骨生成;2、山奈酚的抗骨质疏松作用机制可能与mTOR信号通路有关。