X射线作为一种电离辐射，在医学中有着广泛的应用，如恶性肿瘤的放射治疗。但其对骨骼的影响主要表现在骨坏死、骨折延迟愈合等。经典理论认为辐射破坏骨和骨痂周围的血运、直接杀灭骨细胞和成骨前体细胞，降解骨基质等，而这一结论是基于中高剂量的电离辐射的相关研究得出的。骨科疾病患者常常需要接受多次X射线的照射，例如患者接受X-CT、摄片检查；术中接受X射线透视，所受的照射剂量一般小于1Gy，属低剂量范围水平。所以研究X射线照射对骨科相关疾病的作用，尤其是低剂量X射线的作用，具有重要的意义。但低剂量X线照射对骨科相关疾病作用的研究甚少，此前我们的一些实验研究发现，对大鼠闭合骨折模型，用1Gy X线的照射，促进了骨痂中微血管的形成，从而加速骨折愈合。众所周知，成骨细胞作为骨组织中重要的组成部分，是骨发生和骨形成的关键细胞之一。本实验旨进一步研究低剂量X射线对骨折愈合过程中骨痂形成的影响，并探求促进骨形成、骨生长的机理--充足的成骨细胞的增殖、分化和功能的表达是骨形成的必要条件，即了解低剂量X线照射是否能促进成骨细胞的增殖、分化和功能表达，以及对相关的信号传导通路的影响。本课题包括四个部分一、构建体外培养的成骨细胞模型为了获得大量具有成骨活性的成骨细胞，本实验以MC3T3-E1Subclone14（小鼠颅顶成骨前体细胞亚克隆14）为研究对象，经体外成骨诱导培养后，利用碱性磷酸酶染色、Von kossa染色、RT-PCR和Western Bolt检测成骨标志物等方法进行成骨细胞鉴定。结果显示：经诱导培养的MC3T3-E1Subclone14符合成骨细胞的生物学特性，并具有良好的活性。结论：MC3T3-E1Subclone14可以作为体外培养的成骨细胞模型。二、低剂量X射线对体外培养的成骨前体细胞增殖和分化的影响将MC3T3-E1细胞予以单次、剂量分别为0（对照）、0.1、0.5、1.0Gy的X射线照射。MTT法、BrdU渗入评价细胞的增殖；流式细胞技术和Annexin V-FITC/PI双标评价细胞周期和凋亡；碱性磷酸酶（ALP）活性检测、Von kossa染色、Real-time PCR和Western Bolt分别检测成骨细胞分化的一些标志物。结果显示：不同剂量组细胞的增殖、周期和凋亡差异无统计学意义。尽管无明显的线性关系，0.5和1.0Gy组的ALP活性、矿化结节的数目、分化标记物（I型胶原、骨钙素（OCN）、核心结合因子（Cbfa1））基因和蛋白的表达、以及骨保护素（OPG）/核因子-kB配体受体激活蛋白（RANKL）基因表达的比率均高于对照组，差异有统计学意义。而0.1Gy组与对照组差异无统计学意义。结论：0.5和1.0Gy的X射线照射促进了成骨细胞的分化。三、低剂量X线照射对大鼠骨折愈合过程中骨痂形成和成骨性标志物的影响128只雄性SD大鼠随机分为4组，每组32只。制作标准的右侧股骨中段闭合骨折模型，即刻对大鼠骨折区域予以单次、剂量分别为0（对照）、0.1、0.5、1.0Gy的X射线照射。分别于术后10天、2、3、4周处死大鼠获取骨折标本。每组每个时间点随机选取4个标本，用于组织学观察——HE染色和免疫组化标记，镜下观察骨痂形成和成骨标志物的变化。剩余4个标本real-time PCR检测一些成骨性标志物mRNA表达的变化，结果显示：1. HE染色观察骨痂形成。1.0Gy组硬骨痂较对照组增多，软骨内化骨较对照组早，4周时，1.0Gy组开始有髓腔的形成。2.免疫组化观测骨痂中成骨标记物。随着时间的进展，各组中OCN表达逐步升高，0.5和1.0Gy组OCN染色阳性细胞数较对照组多，差异均有统计学意义。随着时间的进展，各组中Cbfa1表达先升高，在术后第3周达到高峰，第4周已降低。术后第2和3周，0.5和1.0Gy组Cbfa1染色阳性细胞数较对照组多；第4周，0.5和1.0Gy组Cbfa1染色阳性细胞数较对照组少，差异均有统计学意义。3.成骨性标志物mRNA表达的变化。尽管ALP、I型胶原、II型胶原、OCN、Cbfa1表达处在差异，但较为一致的是，在10天时，各组变化差异不明显，术后第2和3周，与对照组相比，0.5和1.0Gy组的成骨性标志物的峰值较高，且提前出现。结论：0.5和1.0GyX射线照射促进了骨折愈合过程中骨痂的形成和成骨性标志物的表达。四、低剂量X射线对MC3T3-E1细胞基因表达谱的影响为了了解低剂量X射线对成骨细胞基因表达谱的影响，我们选取了罗氏NimbleGen小鼠表达谱芯片进行检测。MC3T3-E1细胞经1Gy X射线照射后，继续成骨诱导培养14天后，收集细胞。未照射细胞作为对照组，每组各3个样本。细胞的RNA被抽提并纯化，RNA的完整性经过琼脂糖变性胶检测后，每个样本取5μgRNA进行杂交和标记，步骤如下：RNA的逆转录；双链cDNA的标记；芯片杂交和洗涤；杂交芯片的扫描；扫描获取图像的数据分析。样本经标准化后，应用T检验筛选出p<0.05，任意两个实验组之间差异表达在1.3倍以上的基因为差异基因。结果显示成骨细胞经1.0Gy的X射线照射后，共发现740个差异基因，其中384个上调，356个下调。再对这些差异基因进行GO和Pathway分析，最后进行聚类分析，以了解这些基因在成骨细胞生物学过程中的作用。发现1.0Gy的X射线促进了调节成骨细胞分化、钙化基因的明显上调。一些调控细胞外基质、局部粘附、细胞骨架和血管形成的基因也明显上调。而且还发现与细胞生长因子活动有关的基因如表皮生长因子受体、成纤维生长因子、胰岛素样生长因子也明显上调。由此可见，1.0Gy的X射线促进成骨细胞分化和钙化，可能与细胞外基质-局部粘附-细胞骨架途径和生长因子相关信号通路有关。综上所述，本实验从动物实验和细胞实验两方面，初步探索了低剂量X射线对骨折愈合过程中骨痂形成的影响，并从细胞和分子水平研究其对成骨细胞的增殖、分化、以及相关信号传导通路的影响。发现0.1Gy的X射线对骨折愈合和成骨细胞增殖和分化无明显影响，存在阈值效应。0.5Gy和1.0Gy的X射线促进了骨折愈合过程中骨痂形成和成骨细胞的分化，为低剂量X射线对骨科相关疾病的影响提供了理论依据。