[目的]：1.采集昆明医科大学第一附属医院体检中心正常志愿者的血液标本设为正常对照组,采集昆明医科大学第一附属医院骨科手术后经血管超声诊断无血栓形成患者的血液标本设为创伤对照组,采集昆明医科大学第一附属医院部分病人(血管外科,骨科,普外科,干疗科,妇产科等)科室的住院患者,经超声筛查确诊下肢有DVT形成者,收集详细的患者的血液样本设为血栓实验组。各组血液样本通过离心机高速离心后提取人血清样本,通过ELISA实验技术分别测定各实验组中人血清样品中28个蛋白因子在人血清中的表达变化,筛选出候选蛋白,为后期实验提供必要的数据和理论基础2.通过生物信息学技术对上述实验筛选出的候选蛋白VEGF、ENOS,对其在人血清中的表达变化进行分析,讨论VEGF、ENOS表达量变化与血栓形成关键角色血管内皮细胞膜的关系,建立其与DVT形成的联系,为后期分子生物学机制研究提供理论基础及切入点。[材料和方法]：本课题前期实验回顾。1.在本课题的前期研究中,2003年已成功建立大鼠、家兔创伤性深静脉血栓形成动物模型,在动物模型的基础上,明确了创伤后血栓形成、演化的基本规律,对创伤性深静脉血栓大鼠模型血管组织进行了两次基因芯片检测,分别对血栓形成前期、血栓形成高峰期和血栓形成消退期应用倍数分析等方法进行数据分析,在动物模型中发现32个基因参与到血栓形成、消退的信号调控网络中,其中,凝血相关基因有PC,PS等13个,抗凝相关有Tfpi2等2个,纤溶相关基因有Fgfr2等17个,抗纤相关基因有Plat等2个。2.在本课题的前期研究中,2005年在大鼠模型血液中用Real time-PCR技术检测了MCP-1、ICAM-1、IL-18、IL-6等,证实了其在大鼠血液中的变化趋势与在大鼠血管组织中的变化趋势一致,可以通过在血液中进行检测来预测诊断大鼠深静脉血栓。3.在本课题的前期研究中,在蛋白数据库中查询DVT关键基因的编码蛋白,确定了21个已知结构的蛋白(eNOS,vwf,VCAM-1等),2009年在大鼠模型血液中应用ELISA技术检测了IL-18、TF、VEGF等蛋白水平的变化,证实了血管组织和血清检测结果的一致性,分析作为预测诊断指标的可行性,并检测其敏感性及特异性。4.在本课题的前期研究中,2012年对深静脉血栓患者的人血清样本进行蛋白双相电泳检测,验证了上述21个蛋白的可靠性,同时发现了PSGL-1等7个差异蛋白在检测结果中有表达变化。5.本次实验是在以上前期工作的基础上,通过生物信息学分析,发现PC, PS等蛋白因子在抗凝中发挥作用,IL-1、IL-6、IL-18等蛋白因子在炎性反应中起作用,VWF、VEGF、ENOS等蛋白因子在内皮细胞上起作用,本次实验通过ELISA技术验证前期工作筛选出的28个DVT相关蛋白在各实验组中人血清中的表达变化。第一部分：人血清中28个DVT相关蛋白因子筛选1.1实验分组及人血清样本采集制定临床血液样本采集标准,并根据临床样本的观察时间和血栓形成情况进行如下分组：正常对照组(A组,20例)、创伤后血栓未形成组(B组,20例),创伤后血栓形成组(C组,30例),获取各组血液样本,通过离心提取血清样本。1.2ELISA实验验证人血清中28个DVT相关蛋白因子表达变化。用ELISA实验测定各实验组中人血清样品中28个蛋白(eNOS、Fgfr2、Gnb1、 GP1b-α、GSK3β、HIF-1α、ICAM-1、IL-lα、IL-6、IL-18、MCP-1、MCP-2、MCP-3、 MCP-9、NF-kB、PC,PS,PSGL-1、TF, TFPI2, TLR4, TLR9,TM, VCAM-1,VEGF, TNF-a、 Vwf、β2-GP等)在血清中的表达变化,筛选出候选蛋白,为后期实验提供必要的数据和理论基础第二部分VEGF、ENOS在DVT患者血清中的表达变化和功能分析通过生物信息学技术对上述实验筛选出的候选蛋白VEGF、ENOS,对其在人血清中的表达变化进行分析,讨论VEGF、ENOS表达量变化与内皮细胞膜稳定性的联系,探索建立其与血栓形成的机制,为后期进一步在细胞、分子水平研究DVT提供理论基础和切入点。[结果]1.人血清中28个DVT相关蛋白因子筛选结果本实验完成了45例人血清样本中28个蛋白的ELISA检测。本实验,有九个蛋白组间存在差异。1.DVT组蛋白的表达与正常组、创伤组相比有差异,正常组与创伤组相比无差异的两个蛋白为eNOS、VEGF。2.DVT组蛋白的表达与正常组、创伤组相比无差异,正常组与创伤组相比有差异的两个蛋白为IL-6、β2-GP3.创伤组蛋白的表达与正常组、DVT组相比无差异,正常组与DVT组相比有差异的两个蛋白为MMP-2、NF-Kb和Protein C4.正常组与创伤组相比有差异,创伤组与DVT组相比有差异,正常组与DVT组相比无差异的一个蛋白为ICAM-1和和GP1b-a2.VEGF、ENOS在DVT患者血清中的表达变化和功能分析通过生物信息学分析发现,血管内皮细胞损伤后,VEGF的释放减少,通过P13K、AKT等信号通路、调控ENOS及一氧化氮(NO)的表达降低,NO通过结合血管内皮细胞膜上的受体,使血管内皮细胞膜的通透性及蛋白骨架结构改变,引起血管内皮细胞膜的稳定性下降,增加血小板与内皮细胞的粘附,促DVT形成。本研究发现VEGF、 ENOS在DVT患者血清中的表达下调,其表达变化趋势与血栓形成生物学过程相符,可能对深静脉血栓的诊断有意义。[结论]1.本实验初步筛选出可能与DVT形成相关的两个候选蛋白(eNOS、和VEGF) VEGF、ENOS在DVT患者血清中的表达下调。2.通过生物信息学分析,ENOS、和VEGF可以通过一系列的调控机制,调节NO的释放,影响内皮细胞膜的稳定性,增加血小板与内皮细胞的粘附,影响DVT的形成,本研究中VEGF、ENOS的表达与血栓形成生物学过程相符,可能在DVT的形成中有重要作用。