新城疫(Newcastle Disease,ND)是由新城疫病毒((Newcastle Disease Viruse,NDV)引起的多种禽类发生感染和高度死亡的一种急性、接触性传染病。强毒感染易感禽常呈败血症经过,传播迅速,常给养禽业造成重大经济损失。血凝素-神经氨酸酶(HN)是构成NDV囊膜表面突起的一种结构糖蛋白,这种糖蛋白具有血凝素和神经氨酸酶两种活性,是NDV的一种保护性抗原,具有良好的免疫原性,在NDV侵染过程中起着识别细胞受体的作用。实验证明,雏鸡早期抵抗新城疫感染的机制主要依靠的是呼吸道和消化道的局部免疫作用。此外由于新城疫病毒是副黏病毒,对黏膜有特殊的亲嗜性,极易经呼吸道和消化道感染,弱毒疫苗经滴鼻、点眼、饮水和气雾途径免疫,均可产生S-IgA而建立相应的黏膜免疫。产生的S-IgA对机体呼吸道、消化道等局部免疫具有相当重要的作用,是机体免疫的一道“屏障”,在新城疫的预防接种中,局部免疫作用利于封锁入侵门户,是防制的最好措施。因此,黏膜免疫研究对新城疫的防治有着十分积极的意义。本研究采用RT-PCR方法,从新城疫病毒F48E9株基因组中克隆、鉴定了HN基因,并在大肠杆菌和乳酸菌中进行了高效表达。为新城疫病毒重组基因工程乳酸菌疫苗的研制和乳酸菌介导粘膜免疫的研究奠定重要基础。本实验的主要内容包括:1.新城疫病毒HN基因的克隆与序列分析通过设计一对带有SacⅠ和KpnⅠ酶切位点的引物,利用RT-PCR方法从新城疫病毒中扩增出HN基因,将扩增产物克隆至pMD18-T载体,转化至受体菌JM109中,通过质粒提取、限制性内切酶酶切、PCR、序列测定等方法鉴定,构建出重组阳性克隆质粒pMD18-T-HN。经DNASTAR软件分析核苷酸序列,结果显示HN基因为1716 bp,与Genbank中登陆的相应HN基因大小一致,同源性达到99.4%。2.新城疫病毒重组表达载体pW425et-HN的构建及在大肠杆菌中的表达将纯化的HN基因亚克隆至双标记表达载体pW425et中,构建出可以在大肠杆菌与乳酸菌之间穿梭表达的原核表达重组载体pW425et-HN。经IPTG诱导,SDS-PAGE分析,融合表达的蛋白分子量约为66 kD。Western blotting免疫印迹表明所表达的蛋白具有良好的反应原性。3.重组质粒pW425et-HN在乳酸菌中的表达优化电转化条件后,将已构建的新城疫病毒重组质粒pW425et-HN,电转化至嗜酸性乳杆菌中。对筛选到的阳性克隆,采用SDS-PAGE进行鉴定,可见约66kD的融合蛋白。经Western blotting分析表明该蛋白具有与鸡新城疫多克隆抗体的反应原性。实验结果表明,新城疫病毒HN基因在乳酸菌中获得成功表达,为开发研制预防新城疫病毒的基因工程乳酸菌疫苗奠定基础,同时为乳酸菌介导黏膜免疫传导途径和可能作用机制的研究奠定实验基础。