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当生物体受到电离辐射、化学诱变剂和病毒感染等外界侵害时,体内核酸分子(DNA或RNA)的正常生理机能会遭到严重破坏。例如,DNA中的碱基被移除形成空位、DNA中3’端的羟基基团被磷酸化和DNA中鸟嘌呤(G)被氧化为8-氧鸟嘌呤(8-oxo G)。若上述DNA损伤不能及时得到修复,就有可能造成机体细胞的死亡、引发基因突变进而恶性转化为肿瘤细胞。为维持机体内遗传信息的正常表达和生理机能,细胞内大量的生物活性分子参与到DNA修复过程中。例如:肿瘤抑制基因p53DNA通过修复细胞内基因缺陷,作为“基因组的保护盾”控制癌细胞生长;T4多核苷酸激酶(T4 PNK酶)可将DNA 3’-磷酸基团恢复为正常羟基,有效地阻止病变;甲酰胺嘧啶-DNA糖基化酶(FPG酶)可识别并移除损伤DNA片段中的8-oxo G,恢复其正常生理机理。因此构建一种可快速灵敏检测上述生物活性分子(p53 DNA、T4PNK酶、FPG酶)的方法,对于研究DNA损伤修复、相关肿瘤疾病的发生机理和开发肿瘤疾病早期诊疗方法提供强有力的理论和技术支持。由于p53 DNA和DNA修复酶(T4 PNK、FPG)等生物活性分子在细胞内呈低丰度表达。而常规的核酸分子探针(分子信标)由于检测灵敏度较低,难以对细胞裂解液中上述生物活性分子进行灵敏检测。因此,构建高灵敏度的新型核酸分子探针迫在眉睫。为实现对低丰度生物活性分子检测,要求所构筑的探针应具备以下条件:(1)能够对信号进行富集和扩增,提高灵敏度;(2)能够降低复杂基底的背景信号,提高信噪比。本论文拟利用核酸探针与磁性Fe3O4纳米颗粒构筑集靶标识别、信号转导和信号放大于一体的多功能核酸探针;借助磁性纳米Fe3O4大的比表面、快速的磁响应等特点,消除体系中多余核酸探针引起的假阳性信号,通过与复杂样品基底分离,降低背景信号;充分结合线性(指数型)滚环扩增反应实现信号的多级放大,以实现p53 DNA和DNA修复酶(T4 PNK、FPG)的灵敏检测。主要内容包括:1、基于滚环扩增反应和磁性Fe3O4纳米颗粒构建自发成环多功能核酸探针用于FPG酶活性检测构建了一种基于滚环扩增(RCA)反应和磁性Fe3O4纳米颗粒的自发成环多功能核酸探针。该探针将FPG酶的识别位点(8-oxo G)嵌入到部分杂交双链核酸探针中。靶标FPG酶可将损伤DNA链上的8-oxo G识别并移除,形成5’端磷酸化的碱基末端,满足自发成环的碱基末端条件即5’磷酸端与3’羟基端在T4连接酶作用下连接成环,作为RCA的底物和模板触发RCA反应。RCA产物可分别与FAM修饰的DNA探针(FP)及磁性微珠(MB)修饰的DNA探针(BP)互补,经磁场分离消除游离FP探针的干扰,提高信噪比,使FPG的最低检测限达1.033 U/m L。通过荧光光谱和共聚焦激光扫描显微镜并结合磁分离技术实现了在人血清中FPG的含量检测。这些结果表明,本工作所提出的方案可灵敏性监测FPG的活性,有望用于DNA氧化损伤相关的临床诊断和治疗。2、基于超支化滚环扩增反应构建多功能磁纳米探针用于T4多核苷酸激酶活性检测首先在磁球上负载一个颈部部分杂交且3’端磷酸化的发卡基底探针,该探针在T4PNK酶作用下可以将3’端磷酸化修复为正常的羟基端,随后在聚合酶作用下链长长生成完整的发卡结构,经Nb.Bsm I切割酶切割得到的DNA片段为初级引物,触发后续的超支化滚环扩增反应,得到大量二级产物DNA双链。利用SYBR Green I选择性嵌入双链并增强荧光的特点,将嵌入荧光染料的双链与磁纳米探针结合与多余底物探针分离,降低背景干扰,实现对T4 PNK酶的灵敏检测,检测限可达0.0436 m U/m L。此外,我们进一步在Hela细胞裂解液中进行了T4 PNK酶活性检测并且做了抑制剂药物筛选实验,均取得满意效果。3、基于滚环扩增反应和荧光脂质体构建三螺旋磁纳米探针用于免标记荧光检测p53DNA利用链霉亲和素-生物素相互作用,将链霉亲和素修饰的三螺旋核酸探针与生物素修饰的磁性Fe3O4进行偶联形成三螺旋磁纳米探针。该三螺旋核酸探针的外层发卡序列与p53 DNA的有效片段满足碱基互补原则,利于靶向识别p53 DNA。而被三螺旋结果包围在中间的核酸短链为触发RCA反应的引物链。在目标p53 DNA存在下发卡被打开中间引物链被释放,从而触发后续的RCA反应。RCA产物可与包裹有SYBR Green I(SG)的脂质体-DNA探针杂交,经磁场分离可避免底物探针的干扰,加入破碎剂后可产生强的荧光信号,实现了对p53 DNA的免标记灵敏检测。本文所提出的三螺旋磁纳米探针对p53 DNA的检测限可低至0.07 f M,优于文献中报道的基于光学传感原理对p53 DNA的检测限。为考察该方法对实际样品的检测能力,我们通过加标回收的方法,对细胞裂解液中p53 DNA进行了相应分析,得到了满意结果。因此,本文所提出的方法可用于复杂的生物样品中p53 DNA的灵敏检测,有望在临床上得到进一步应用。