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【目的】构建以人3型腺病毒为载体的衣壳嵌合型肠道病毒71型表位疫苗候选株,为人3型腺病毒衣壳嵌合载体的应用及肠道病毒71型疫苗构建奠定基础。 【方法】以搭桥PCR方法扩增高变区嵌合肠道病毒71型(EV71)SP70表位的六邻体基因片段,酶切连接克隆至穿梭载体pBRHexonL/R上,穿梭质粒与骨架质粒pBRAd△E3GFP分别酶切后在BJ5183菌内同源重组,PCR及酶切、测序鉴定并线性化重组质粒,转染AD293细胞拯救重组腺病毒,并大量培养纯化腺病毒粒子。热稳定性实验和生长曲线实验、EGFP表达荧光检测分析重组腺病毒的特性,Western blot实验和ELISA实验分析SP70表位在六邻体上的融合表达及在重组病毒粒子表面的暴露情况。重组腺病毒多次免疫小鼠,Western blot、ELISA、ELISpot等实验检测免疫小鼠的体液免疫反应和细胞免疫反应,微量中和实验检测抗血清体外中和EV71病毒的活性。采用EV71致死性感染的乳鼠模型分析重组腺病毒免疫介导的体内抗EV71感染的保护作用。 【结果】SP70嵌入HVR4或HVR5区的重组病毒未能成功拯救得到;而SP70嵌入HVR1、HVR2、HVR7区则成功拯救出重组腺病毒R1SP70A3、R2SP70A3和R7SP70A3,并且没有影响病毒的热稳定性和生长特性以及EGFP转基因表达。SP70表位在六邻体蛋白的相应区域融合表达并且暴露在病毒粒子表面。重组腺病毒初次免疫小鼠即诱导出SP70肽特异的抗体,多次免疫后SP70特异性的抗体应答得到加强,相反,重组腺病毒的转基因产物EGFP的抗体应答在多次免疫后未能加强。ELISpot实验未能检测到SP70肽特异的细胞免疫应答。重组腺病毒R1SP70A3、R2SP70A3相较R7SP70A3和SP70-GST融合蛋白免疫小鼠诱导出更高滴度的IgG抗体和中和性抗体,并且在乳鼠模型中对致死性EV71感染提供更有效的保护作用。 【结论】外源表位SP70可以以置换方式嵌入人3型腺病毒六邻体HVR1、HVR2、HVR7区,没有影响病毒生长特性和稳定性;重组腺病毒R1SP70A3、R2SP70A3在小鼠体内诱导出SP70表位特异的中和作用抗体,对小鼠提供抗EV71感染的保护作用,多次免疫后免疫应答仍能加强,是一种有用的EV71疫苗候选株;六邻体修饰的Ad3载体可以作为表位展示和抗原呈递的载体应用于其它病原体和癌症疫苗研究。