前言肿瘤干细胞(tumor stem cell)是存在于肿瘤细胞群体中的少数干细胞样癌细胞亚群,与肿瘤进展和转移的发生密切相关。它具有干细胞的特性,能够自我更新并通过种植到生物体内形成与原发灶相似的肿瘤细胞。由于肿瘤干细胞具有天然耐药性,能将药物泵出细胞膜外,因此人们已经怀疑肿瘤干细胞是否就是传统肿瘤化疗方法对于肿瘤的治疗效果有限的根源。现在应用于临床上的抗卵巢癌药物繁多,但无论是联合用药还是单独用药,这些药物的作用对于临床病人的治疗效果都很有限。常用的传统药物有:阿霉素,顺铂,环磷酰胺等,它们都是细胞周期非特异性药物,对肿瘤细胞的DNA具有毒性。这些药物对肿瘤干细胞的杀伤作用有限。因为在肿瘤干细胞膜上存在一种膜转运子ABCG2,它是一种ATP依赖的结合转运体家族,能够将药物泵出细胞外,使细胞具有天然的多重耐药性。同时有实验表明脑胶质瘤细胞中的CD133~+亚群对阿霉素具有抵抗作用,因此我们选用阿霉素和卵巢癌治疗的常用药顺铂作为传统抗肿瘤药物的代表来进行卵巢癌类干细胞对传统药物的药敏实验。钙通道蛋白阻滞剂维拉帕米是ABC家族的抑制剂,能够逆转表达ABCG2膜蛋白的多重耐药,使肿瘤干细胞迅速死亡。因此我们同时尝试用维拉帕米来阻断ABCG2蛋白,观察其是否对传统药物耐药存在逆转作用以初步分析肿瘤耐药的相关因素。材料与方法一、材料1、卵巢癌细胞株OVCAR3细胞系由中国医科大学附属盛京医院妇产科副教授周欣提供。为实验对照组。卵巢癌类干细胞:OVCAR3细胞系进行无血清培养,第五代所形成的细胞团中卵巢癌类干细胞大约可占10%。取五代之后的细胞用于实验。为实验组。2、细胞培养提取卵巢癌类干细胞富集的细胞团:将OVCAR3细胞从含15%FBS的DMEM培养液中取出,种于铺有琼脂的6厘米培养皿中,加入无血清的DMEM/F12培养液,隔天半量换液,4-5天形成细胞团,传数代后形成富集卵巢癌类干细胞的细胞团。3、用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测化疗药物对OVCAR3和卵巢癌类干细胞的抑制作用及维拉帕米对其的影响OVCAR3细胞或卵巢癌类干细胞的单细胞悬液每孔100μL,含有细胞数为6000.化疗药每孔10μL,DMEM培养液每孔90μL。阴性对照组不加抗癌药,空白对照组每孔只加200μL培养液。重复实验三次,测定每次的相对抑制率。4、用软琼脂克隆实验检测OVCAR3细胞和卵巢癌类干细胞对阿霉素及顺铂的抑制率及维拉帕米对其的影响。方法如下:下层0.6%浓度的琼脂中不含有细胞,上层0.3%浓度的琼脂中含有OVCAR3细胞或卵巢癌类干细胞。表面覆盖条件液(条件液中含有化疗药物)。3周后观察形成的克隆数。重复上述实验三次,收集数据,进行统计学分析。实验结果1、培养出的卵巢癌细胞形态学观察具有干细胞的生长特点,前期实验中已验证其具有干细胞特点。卵巢癌类干细胞悬浮生长,形成干细胞样细胞团。2、MTT检测结果.卵巢癌类干细胞与OVCAR3细胞相比,对阿霉素和顺铂有耐药性(P<0.05),维拉帕米能够在一定程度上逆转卵巢癌类干细胞的耐药性(P<0.05)。3、软琼脂克隆实验结果卵巢癌类干细胞与OVCAR3细胞相比,对阿霉素和顺铂有耐药性,维拉帕米能够在一定程度上逆转卵巢癌类干细胞对阿霉素的耐药性,而在此实验中对于逆转顺铂的耐药性作用不明显。结论卵巢癌类干细胞对阿霉素和顺铂这两种治疗常用药有耐药作用,维拉帕米能够在一定程度上逆转卵巢癌类干细胞对阿霉素的耐药作用,MTT实验中维拉帕米能够在一定程度上逆转卵巢癌类干细胞对顺铂的耐药性,而在软琼脂克隆实验中这种逆转作用则不明显。