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氧化应激是指在细胞和组织的氧化和抗氧化体系失衡时,导致氧化自由基和活性氧(ROS)过量产生的一种状态。ROS作为机体代谢过程中产生的一类中间产物,正常生理浓度下,在信号传递与调节细胞功能过程中发挥重要作用。当其产生与清除的平衡被打破,致使ROS过度积累,会引起包括DNA、蛋白质和脂质的损伤,许多疾病如代谢综合症、心血管疾病、癌症、神经系统疾病、糖尿病、缺血再灌注损伤以及衰老等均与此相关。GPx是机体内重要的抗氧化酶,它能够催化多种氢过氧化物的分解,参与机体内ROS的平衡的维持,保护组织细胞免受过氧化损伤。含硒GPx的催化功能依赖于其活性中心的硒代半胱氨酸(Sec),Sec由乳白型终止密码子UGA编码,需要复杂的编码机制才能将UGA低效的翻译为Sec。因此,很难利用细胞自身机制外源表达获得含硒GPx。我们在之前的研究中利用半胱氨酸营养缺陷型大肠杆菌,成功将Sec替代Cys插入到肽链中获得了较高活力的含硒GPx,然而这种方法只能获得不含Cys的突变体,不利于对含硒蛋白的广泛研究。UAG密码子在近年来被广泛用于非天然氨基酸的编码(unnatural amino acid,uAA),实现了大量uAA的定点编码,为蛋白质结构和功能研究提供了重要的手段。作为第二十一种氨基酸,Sec既可划分为天然氨基酸,又可划分为uAA。结合了 uAA编码的成功经验,耶鲁大学Dieter Soll教授设计了既可以参与Sec合成,又可以参与EF-Tu延伸的杂合tRNAUTu用于Sec在UAG密码子处的编码,Ser在SerRS的作用下连接到tRNAUTu上生成Ser-tRNAUTu,并进一步在硒代半胱氨酸合成酶(Selenocysteine synthase,SelA)的作用下生成Sec-tRNAUTu。琥珀型终止缺陷大肠杆菌C321.△A.exp是将大肠杆菌中负责UAG终止的释放因子1(RF1)去除,并将基因组中321个琥珀型终止密码子UAG替换为赭石型终止密码子UAA的工程菌,使得UAG在这一菌株中真正的被赋予编码氨基酸的能力。在本研究中,我们将tRNAUTu引入C321.△A.exp,实现了 GPx的高效表达,通过对tRNAUTu的定向优化,提高了所表达GPx的活力,并利用优化后的表达系统对GPx3及其突变体分子内二硫键进行了表达研究,获得了高活力的GPx3突变体。具体实验结果如下:(1)tRNAUTu用于琥珀型终止缺陷大肠杆菌中hGPx4的表达与表征将hGPx4编码基因中Sec的密码子UGA突变为UAG后,利用tRNAUTu对UAG的编码在C321.AA.exp中表达了活力为18.3 U/mg的hGPx4,虽然活力明显低于天然GPx4,其催化机制与天然GPx4一致均为不饱和的乒乓机制。MALDI-TOF-MS和ESI-MS结果共同确定重组表达的hGPx4氨基端的甲硫氨酸在表达后被甲硫氨酸氨基肽酶切除,ESI-MS结果显示hGPx4中包括GPx446Ser、GPx446Sec和GPx446Glu/Lys/Gln多种组分,对各组分峰强进行计算得出Sec在UAG密码子处的插入比例在20%到30%之间,在不提供外源硒时hGPx4的表达量明显高于提供外源硒时的表达量,提示在C321.AA.exp中Sec-tRNAUTu进入UAG密码子处的速度低于Ser-tRNAUTu进入UAG密码子处的速度。(2)tRNAUTu的优化及鉴定为了减少Ser和天然氨基酸的非特异性插入,我们对tRNAUTu的组成序列进行优化,对tRNAUTu的A stem、T stem和T loop分别替换或组合替换为tRNASec来源的对应部位。获得的7个tRNAUTu突变体虽然均可以表达有活性的甲酸脱氢酶(Formate dehydrogenase,FDH)报告基因并产生颜色反应,但是其中Astem、T stem 和 T loop 与 tRNASec 完全一致的 tRNAUTu3无法在 C321.AA.exp 中表达hGPx4,其余6个tRNAUTu突变体均可成功表达hGPx4。进一步我们表达了 hGPx4和hGPx1,通过GPx活力对比来鉴定各个tRNAUTu突变体在UAG密码子处编码Sec 的效率。结果表明 tRNAUTuT1、tRNAUTuT2、tRNAUTuT4和 tRNAUTuT6 在 UAG位置插入Sec的比例高于tRNAUTu,其中tRNAUTuT6所表达hGPx4和hGPx1的活力最高,分别达到38.1 U/mg和331.4 U/mg,对tRNAUTuT6表达hGPx4进行ESI-MS检测发现GPx446Sec的峰强明显提高,通过对各组分峰强进行计算,Sec在UAG密码子处的插入比例接近50%。在对tRNAUTuT6表达的hGPx1的催化动力学的研究中发现,以四聚体形式存在的hGPx1亚基活性中心之间存在正协同效应。对构建的tRNAUTu突变体序列进行分析,发现在tRNAsec中无法被EF-Tu识别的Astem和T stem在tRNAUTuT2中可以被EF-Tu识别,而在tRNAUTuT3中无法被EF-Tu识别,两者只是在T loop中第59位碱基不同。同样的,tRNAUTuT6和tRNAUTu相比也只是在T loop中第59位碱基不同,却能够表达高活性的GPx。这些结果说明T loop在tRNA参与Sec的合成和编码过程中与相关蛋白的结合发挥重要作用,通过对不同物种tRNASec的高级结构分析,确定tRNAsec的T loop和D loop通过第59位碱基和第16位碱基形成空间碱基对,这一碱基对的形成对tRNASec的D stem和T stem结构产生影响,这两个部位直接参与了 tRNAsec和SerRS、SelA以及EF-Tu之间的结合。(3)hGPx3及其突变体在tRNAUTu优化系统中的表达与表征利用构建好的tRNAUTu优化系统,我们表达获得了具有较高GPx活性的重组hGPx3,其催化活性最适pH值为10,最适温度为50℃,酶促反应动力学结果表明hGPx3的催化机制与hGPx4不同,为底物饱和的乒乓机制,对底物tBuOOH和GSH的表观Km值分别为0.47 mM和5.2 mM。非还原SDS-PAGE结果表明hGPx3存在分子内二硫键,通过定点突变将GPx3分子内的Sec和三个Cys进行组合突变,对突变体蛋白的非还原SDS-PAGE表明,hGPx3的二硫键形成并不是简单的空间接近的Cys12和Cys136之间,当Cys12被突变为Ser或被去除时,二硫键的形成明显加强,说明在天然晶体结构中相距较远的Cys81和Cys136在此情况下容易通过空间位移形成二硫键。当突变体中只有一个Cys时,电泳结果显示仍然有二硫键的形成,说明Sec参与了和Cys之间硒硫键的形成。将Sec突变为Ser后,分子内二硫键形成转变为分子间二硫键形成,表明Sec对hGPx3的结构有较大影响。对突变体的活力进行测定,发现虽然各个突变体二硫键形成情况不同,但是均具有明显的GPx活性,当Cys被完全突变,不存在二硫键时,突变体hGPx3-C12/81/136S活力最高,可能是二硫键消失后,柔性结构更利于底物接近活性中心所致。综上所述,本研究利用优化后的tRNAUTuT6在琥珀型终止缺陷大肠杆菌C321.△A.exp中实现了 GPx的高效表达,为硒蛋白的表达与研究提供了强有力的工作基础。并发现对tRNA的T loop的改造可以通过影响三级结构调节tRNA参与延伸的能力,为tRNA的改造与优化提供了新思路。