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目的评价梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp）重组蛋白rTp0608、rTp0965和rTp1038(TpF1）在梅毒临床血清学诊断中的意义，为发现新Tp诊断抗原提供实验依据。方法从Genbank获取Tp0608和Tp0965基因序列，以Tp Nichols标准株全基因组DNA为模板，PCR扩增其全基因片段；将酶切后的目的片段克隆入原核表达载体pET28a，构建重组载体pET28a-Tp0608和pET28a-Tp0965，经酶切和测序鉴定正确后转化至表达菌E.coli BL21(DE3)中，以IPTG诱导蛋白表达，用SDS-PAGE鉴定蛋白表达形式，Western blot鉴定表达蛋白的免疫反应性；用Ni2+-NTA亲和层析柱纯化重组蛋白，SDS-PAGE分析纯化蛋白的纯度；以纯化蛋白抗原rTp0608、rTp0965和rTpF1(本室保存）单独或联合包被酶标板，以确诊的梅毒阳性血清或阴性血清为一抗，以HRP标记羊抗人IgG为二抗，建立间接ELISA，优化最佳的抗原包被浓度、最佳抗原组合以及该组合的最佳抗原包被浓度，最适血清(一抗）稀释度，筛选出优化后最佳抗原组合的ELISA并检测其重复性；用已优化的rTpF1-rTp0965-ELISA检测确诊的梅毒阳性和阴性血清，统计学分析该方法的敏感性、特异性和一致性；进一步随机检测各期TPPA阳性梅毒血清、TPPA阴性的易发生交叉反应人群(系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、结核病）血清及正常健康人对照血清，同时与TPPA、国产Tp-ELISA试剂盒进行平行比较，初步评价rTpF1-rTp0965-ELISA在梅毒血清学诊断中的应用价值。结果(1) PCR分别扩增出一大小约888bp和960bp的目的片段(含引物），重组质粒经双酶切、测序鉴定与GenBank上公布的序列基本一致，表明插入的目的基因为Tp0608和Tp0965。(2)重组表达载体pET28a-Tp0608和pET28a-Tp0965在宿主菌E.coliBL21(DE3)被IPTG诱导分别表达出相对分子量约为38kDa和43kDa的目的蛋白；表达形式鉴定显示，Tp0608在菌体细胞中以包涵体形式存在，而Tp0965则以可溶性蛋白的形式存在。(3)经Ni2+-NTA亲和层析柱纯化后，rTp0608和rTp0965纯度均在95%以上；Western blot结果显示均与梅毒阳性血清有良好的免疫反应性，而与正常人的血清不反应。(4) ELISA优化结果显示，单抗原包被以TpF1(4μg/Ml）检测A值比(P/N）最高，Tp0608(2μg/Ml）最低；多抗原包被以TpF1(4μg/Ml）+Tp0965(4μg/Ml）检测A值比(P/N）最高；最适血清的反应稀释度为1:200。最佳抗原组合ELISA的批内和批间重复性试验显示，该法的平均变异系数(CV）值均为2.6%(<10%）。(5)用已优化的rTpF1-rTp0965-ELISA方法检测31例确诊梅毒阳性和19例阴性血清，其敏感性和特异性分别为96.7%和100%，总符合率为98.0%；对93份临床血清标本随机进行检测，与TPPA法比较，建立的ELISA法的总灵敏度为96.8%，低于TPPA法(P＜0.05)，特异度为100%，两种方法的总符合率为97.6%；建立的ELISA法与国产Tp-ELISA试剂盒灵敏度均无显著性差异，特异度高于国产Tp-ELISA试剂盒(P＜0.05)。结论(1)成功表达重组蛋白Tp0608和Tp0965，两蛋白有良好的免疫反应性。(2) Tp0608可能不宜作为诊断抗原，TpF1和Tp0965可望成为候选诊断抗原；建立的rTpF1-rTp0965-ELISA具有高度特异性、较好的敏感性和重复性，但其临床应用有待进一步评价和验证。