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女性在围绝经期由于卵巢功能衰退,体内雌激素水平下降导致神经内分泌调节机制失衡而出现的一系列症状,被称为“围绝经期综合征”。研究发现卵泡闭锁是卵巢功能衰退的主要原因,卵泡闭锁的原因在于颗粒细胞的凋亡。对“围绝经期综合征”患者,目前国内外均采用激素替代治疗,虽然疗效肯定,但其存在诸多禁忌症和不良反应等副作用。目前在天然药物中寻找具有激素样生物活性而又无损身体健康的治疗药物是国内外研究的热点。我们对“宁心红杞胶囊”(南京中医药大学和江苏省中国科学院植物研究所研制)进行临床验证,发现其对改善围绝经期各种临床症状具有显著疗效。本课题将探讨该药对围绝经期大鼠卵巢颗粒细胞凋亡及其相关的凋亡基因的影响,阐明其治疗围绝经期综合征的机制,以期为临床运用提供新的理论和实验依据。第一部分:宁心红杞胶囊对围绝经期大鼠卵巢颗粒细胞凋亡影响的体内机制研究目的:围绝经期综合征的发生主要与颗粒细胞的凋亡有关。此部分研究从整体水平观察宁心红杞胶囊对围绝经期大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响,探索其治疗围绝经期综合征的作用机制。方法:取4月龄雌性大鼠为正常对照组,14月龄阴道细胞学表现动情期延长的雌性大鼠作为衰老大鼠模型。模型动物随机分为:模型组、宁心红杞胶囊大、中、小剂量组及阳性药物组。灌药8周后:①股动脉取血放射免疫法测雌激素(Estradiol, E2)、孕激素(Progesterone, P)、睾酮(Testosterone, T)、卵泡刺激素(Follicle stimulating hormone, FSH)、黄体生成激素(Luteinizing hormone, LH);②免疫组化法检测胰岛素样生长因子(IGF-1);③通过流式细胞仪及透射电镜观察卵巢颗粒细胞凋亡情况;④原位末端核苷酸标记法(TUNEL)检测卵巢颗粒细胞凋亡及凋亡相关因子Bcl-2、Bax。结果:与模型组比较:①宁心红杞胶囊能提高血清E2水平,降低FSH、LH水平,促进卵泡生长;②它可使卵巢IGF-1表达增加;③流式细胞仪结果显示宁心红杞胶囊可使卵巢颗粒细胞由G0期向S期和G2/M期转化,电镜下观察发现宁心红杞胶囊使GC胞浆中脂滴体积较前者增大,滑面内质网更丰富,充满胞浆,扩张明显,线粒体数目增多;④宁心红杞胶囊可使卵巢Bcl-2表达增强,Bax表达减弱,Bcl-2/Bax比例增加。结论:宁心红杞胶囊能够明显降低卵巢颗粒细胞的凋亡(P<0.05),明显改善卵巢颗粒细胞内的超微结构,使颗粒细胞分泌E2增多。第二部分:宁心红杞胶囊含药血清对卵巢颗粒细胞凋亡影响的体外机制研究目的:此部分从细胞分子水平来探讨宁心红杞胶囊对离体卵巢颗粒细胞凋亡的影响。方法:取22-27天左右的SD雌性大鼠,注射孕马血清(PMSG)48h后取卵巢颗粒细胞,置于37℃、5%CO2培养箱中培养。用氯化镉制备颗粒细胞衰老模型,加含药血清后,①MTT比色法:筛选出宁心红杞胶囊含药血清的最佳剂量;②用放射免疫方法检测细胞上清中E2水平;③细胞沉淀通过流式细胞仪、电镜及荧光显微镜下观察其凋亡;④用酶标法方法检测凋亡的相关蛋白Caspases-3及相关细胞因子NO。结果:①MTT结果显示氯化镉对卵巢颗粒细胞有明显的损伤作用;通过MTT筛选出宁心红杞胶囊的最佳剂量为中剂量;②细胞上清中的E2水平明显升高;③流式细胞仪和荧光显微镜都显示模型组可见明显的凋亡,用药后凋亡明显减少;④宁心红杞胶囊可使卵巢颗粒细胞Caspases-3和NO表达降低。结论:氯化镉可以造成卵巢颗粒细胞损伤,造模成功(P<0.01)。宁心红杞胶囊含药血清能抑制卵巢颗粒细胞凋亡(P<0.05),颗粒细胞的分泌功能增强,延缓卵巢功能的衰老。综合本文两部分的研究结果,获得如下结论:1、围绝经期动物模型可复制成功。2、宁心红杞胶囊可调整围绝经期大鼠血中激素水平。3、宁心红杞胶囊可抑制卵巢颗粒细胞的凋亡,从而延缓卵巢的衰老。4、宁心红杞胶囊可通过对凋亡基因Bcl-2、Bax和相关蛋白Caspases-3的调控,延缓大鼠卵巢颗粒细胞凋亡,从而达到防治PMS的目的。