论文部分内容阅读
目的: 肾间质纤维化是多种肾脏疾病发展到终末期肾功能衰竭的共同途径。肾间质纤维化的发病机制目前得到了多方面的研究。近年的研究结果表明,小管间质损伤是决定十年肾脏存活率的最重要影响因素,其影响程度远超过肾小球病变程度的影响。肾小管上皮细胞是构成肾小管间质结构的主要细胞之一,正常肾小管周围环境对于维持肾间质的正常生物学行为十分重要,肾小管细胞未控制的过度凋亡导致肾小管局部环境的破坏,可引起肾小管细胞减少、小管萎缩和小管间质纤维化。因此,阻止肾小管细胞过度凋亡,保护肾小管周围环境,可起到预防间质纤维化的作用。环氧化酶(Cyclooxygenase; COX)是前列腺素代谢环节中关键限速酶,其有两种同工酶:COX-1,COX-2。通常认为COX-1参与生理过程,COX-2介导病理环节,多种生长因子、细胞因子和反应性氧代谢产物可诱导COX-2表达上调,在由单侧输尿管梗阻(Unilateral ureteral obstruction; UUO)所引发的肾小管间质纤维化的致病过程中,存在着刺激COX-2大量生成的因素,理论上选择性阻断COX-2在纠正疾病的同时可能不影响机体的生理状态,从而避免了传统非甾体类消炎药物的不良反应。国外新近研究表明,选择性COX-2抑制剂能够减轻UUO大鼠的肾小管间质纤维化病变,认为下调转化生长因子?(Transforming growth factor-???TGF-?)的<WP=4>表达可能是该药的主要作用机制。有研究表明,TGF-?在UUO中可引起肾小管上皮细胞凋亡,抗TGF-?抗体可改善肾小管上皮细胞凋亡情况,故我们推测COX-2抑制剂可能抑制肾小管细胞凋亡,然而,目前有关特异性COX-2抑制剂与肾小管上皮细胞凋亡的研究较少。本实验以UUO建立肾间质纤维化大鼠模型,给以特异性COX-2抑制剂Rofecoxib灌胃方法,作用于该动物模型,取得梗阻侧肾脏标本,采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(terminal deoxynucleotidy1 transferasemediated dUTP nick endlabeling; TUNEL)法检测肾小管上皮细胞凋亡情况及Rofecoxib对肾小管上皮细胞凋亡的影响,结合电镜观察肾小管凋亡细胞形态。并通过免疫组织化学及病理,观察用药前后COX-2、TGF-? 1、Ⅰ型胶原(CollagenⅠ;ColⅠ)的表达及肾脏基本病理变化,测定尿中COX-2代谢产物血栓烷素B2 (thromboxane B2; TXB2)的含量,探讨Rofecoxib对肾间质纤维化的保护机制。方法: 选择清洁级健康雄性SD大鼠45只,随机分为假手术组(A组)、 UUO组(B组)、UUO +Rofecoxib治疗组(C组),各 15只。 B、C组2%戊巴比妥(50mg/kg)经腹腔注射麻醉后,行左侧输尿管结扎术建立动物模型,A组只游离输尿管但不结扎。C组Rofecoxib 10mg/kg.d放于适量自来水中灌胃,造模术前1天开始给药,A、B组给予等量自来水灌胃。各组分别于术后3、7、14天分批处死大鼠,每组5只,处死前24小时代谢笼收集尿液,测尿TXB2浓度,处死后取术侧肾组织行HE、Masson染色,COX-2、TGF-??、ColⅠ免疫组织化学检测,肾小管细胞凋亡检测,结果应用<WP=5>图像分析系统进行半定量分析。结果: HE染色A组未见异常,B组3天可见肾小管轻微扩张,间质中少量单核细胞与淋巴细胞浸润。B组7天可见肾小管扩张,间质中单核细胞与淋巴细胞浸润明显。B组14天肾小管扩张明显,间质中大量单核细胞与淋巴细胞浸润。Masson染色可见B组胶原沉积逐渐增加。C组与B组平行相比,肾小管扩张、间质炎细胞浸润及胶原沉积的程度有显著降低(P<0.01)。TUNEL法肾小管上皮细胞凋亡检测可见A组偶见凋亡细胞。B组术后3、7、14天梗阻侧可检测到较多的凋亡细胞。梗阻3天肾髓质远曲小管和集合管发生大量细胞凋亡,皮质肾小管可检测到少量凋亡细胞,梗阻7天、14天,除髓质外,皮质肾小管凋亡细胞逐渐增多,B3、B7、B14之间有显著差异(P<0.01),而C组与B组平行相比,凋亡细胞明显减少(P<0.01)。免疫组织化学结果提示ColⅠ在A组仅为沿肾间质的线样分布,只在肾间质中有少量表达,小球及小管中无阳性表达,A3、A7、A14组间无差异(P>0.05),B组可见ColⅠ大量表达于肾间质,同时部分肾小管细胞胞浆中也有表达。 B3、B7、B14表达量显著上升,随着模型时间延长,ColⅠ表达范围逐渐增大,B3、B7、B14组之间差异显著(P<0.01)。C组与B组平行相比,ColⅠ表达量有显著降低(P<0.01)。TGF-β1在A组少量表达于肾小管细胞胞浆,A3 、A7、A14之间无差异(P>0.05)。随着模型时间延长,B3、B7、B14组较A组表达明显增加(P<0.01),C 组与B组平行相比TGF-β1表达减少(P<0.01)。COX-2在A组大鼠肾皮质未见明显表达,而B组的COX-2蛋白生成量大大增加,表达于肾小管细胞胞浆。C组与B组平行相<WP=6>比COX-2蛋白表达明显减少(P<0.01)。尿TXB2水平A3、A7、A14组之间无明显差异(P>.05),B组尿TXB2水平较A组明显增加(P<0.01),C组与B组平行相比,尿TXB2水平降低(P<0.01)。结论: COX-2参与了UUO发生发展的病理过程。特异性COX-2抑制剂Rofecoxib通过阻断UUO大鼠肾组织COX-2活性,下调其蛋白表达,阻断病理性前列腺素TXB2的生成;下调TGF-??的蛋白合成,减少肾小管细胞的过度凋亡;下调ColⅠ,减少细胞外基质异常积聚,维持肾脏正常生理结构,?