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研究背景:急性肺损伤(acute lung injury,ALI)/急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是由于创伤、烧伤或败血症等因素引起的以急性、进行性非心源性呼吸衰竭为特征的疾病,是临床上常见的难治性危重症,具有较高的死亡率。尽管医务工作者做了大量的相关工作,但到目前为止,尚缺乏治疗ALI特异有效的方法。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是ALI的常见致病因素之一。许多研究证明,LPS能结合于单核/巨噬细胞表面的CD14受体,并促进细胞产生大量的细胞因子与炎性介质。近年来,缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)被认为在LPS诱导的炎症反应的发生发展过程中起了重要作用。文献表明,LPS能诱导多种细胞表达HIF-1α,尤其是单核细胞和巨噬细胞。与缺氧和其他刺激不同的是,LPS通过增加HIF-1α的mRNA水平,促进蛋白翻译,并抑制其降解来诱导HIF-1α表达的增加。研究进一步表明,HIF-1α在髓样细胞介导的炎症与LPS通过TOLL样受体4(toll like receptor 4,TLR4)诱导的败血症中起了非常重要的作用。同时,HIF-1α也参与了皮肤和关节中巨噬细胞的炎症反应,并能促进巨噬细胞的吞噬功能。因此,限制巨噬细胞内HIF-1α介导的炎症反应可能有益于减轻炎症相关的组织损伤。丹参酮IIA (tanshinone IIA,TIIA)是唇形科植物丹参中的脂溶性活性成分之一,大量文献报道TIIA具有抑制炎性介质与氧自由基释放的作用。我们以前的实验表明TIIA能显著降低LPS导致的小鼠的死亡率,并能减轻在体和离体实验中LPS导致的肺损伤。但是,目前尚不清楚TIIA是如何减轻LPS性肺损伤的。本实验拟观察TIIA对内毒素血症时炎症反应的影响,研究TIIA对LPS性肺损伤的保护作用是否与HIF-1α有关,并进一步探索TIIA是如何调节HIF-1α的表达。实验目的:(1)观察TIIA对内毒素性肺损伤时炎症反应的作用;(2)研究LPS诱导巨噬细胞中HIF-1α表达的作用;(3)研究TIIA对LPS诱导的HIF-1α表达的抑制作用;(4)探索TIIA抑制LPS诱导的HIF-1α表达的作用机制。实验方法:动物实验雄性BALB/c小鼠(18 - 22 g)适应环境后,腹腔注射LPS建立小鼠肺损伤模型,随机分为四组:1)生理盐水(NS)对照组(n = 8),给小鼠注射两次NS,时间间隔为0.5小时;2)TIIA对照组(n = 8),先给小鼠注射TIIA,0.5小时后注射生理盐水;3)LPS组(n = 8),先给小鼠注射NS,0.5小时后注射LPS;4)TIIA/LPS组(n = 8),先给小鼠注射TIIA,0.5小时后注射LPS。在各组,腹腔注射NS、TIIA(10 mg/kg)和LPS(10 mg/kg)。在第二次注射后6小时取肺进行病理观察,或进行支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)灌洗,观察BALF中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)的含量、总细胞与中性粒细胞的数目,检测血清与BALF中肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)、白介素(interleukin,IL)-1β、IL-6的含量,以及Western blotting检测小鼠肺组织中HIF-1α的含量。细胞实验为了观察LPS对HIF-1α表达的诱导作用,指数生长期的NR8383与RAW264.7巨噬细胞被血清饥饿16 - 20小时后,用不同浓度的LPS(0.5 - 10μg/ml)刺激0 - 8小时,或用LPS(1μg/ml)刺激6小时,Western blotting检测HIF-1α的表达。为了研究TIIA对LPS诱导的炎症因子释放、HIF-1α表达的作用及其相关机制,指数生长期的NR8383与RAW264.7巨噬细胞被血清饥饿16 - 20小时后,用0 - 20μg/ml的TIIA预处理细胞0.5小时后,LPS(1μg/ml)刺激6-12小时,取细胞上清测定炎症因子的含量,或收集细胞提蛋白进行Western blotting检测相关蛋白的变化。为了观察HIF-1α在炎症反应中的作用,将HIF-1αsiRNA转染于RAW264.7细胞。转染后细胞被LPS(1μg/ml)刺激12小时,观察细胞培养液中TNF-α、IL-1β与IL-6的变化。实验结果:(1)TIIA预处理改善LPS导致的肺损伤腹腔注射LPS明显增加BALF中的LDH的含量(P < 0.01),说明LPS导致了小鼠急性肺损伤。但是,TIIA预处理显著地抑制了LDH含量的增加(P < 0.05),即TIIA能够减轻LPS导致的肺损伤。形态学观察表明LPS组中肺组织明显充血、水肿并有大量炎性细胞的浸润,而在TIIA/LPS组内毒素所致的肺损伤明显减轻,肺组织结构趋于正常。(2)TIIA预处理减轻LPS导致的炎症反应LPS能够显著增加BALF中总细胞与中性粒细胞的数目(P < 0.01),但TIIA预处理显著地抑制了上述指标的增加(P < 0.05),说明TIIA能够减轻LPS导致的炎性细胞浸润。在正常小鼠的血清与BALF中,TNF-α、IL-1β与IL-6的含量极低;但这些炎症因子在LPS组明显增加(P < 0.01)。在TIIA/LPS组,上述炎症因子的含量较LPS组明显降低(P < 0.05)。同时,在RAW264.7巨噬细胞上清液中,TNFα、IL-1β与IL-6的含量在LPS组均较对照组明显升高(P < 0.05;P < 0.01),但TIIA预处理浓度依赖性地降低了这些炎症因子的含量(P < 0.05;P < 0.01)。(3)HIF-1α在LPS诱导的炎症反应中的作用LPS(0.5 - 10μg/ml)刺激NR8383与RAW264.7巨噬细胞6小时后,HIF-1α的表达增加,并且这种诱导作用是LPS浓度依赖性的。用LPS(1μg/ml)刺激两种巨噬细胞0 - 8小时,HIF-1α的表达在LPS刺激2小时后增加,在6 - 8小时达高峰。将HIF-1αsiRNA转染于RAW264.7细胞,可显著降低LPS刺激RAW264.7细胞时TNF-α、IL-1β与IL-6的分泌量(P < 0.05),提示HIF-1α参与了LPS诱导的炎症反应。(4)TIIA抑制LPS诱导的HIF-1α的表达同对炎症因子的抑制效果相似,在NR8383与RAW264.7巨噬细胞中,不同浓度TIIA预处理(0 - 20μg/ml)可以浓度依赖性地抑制LPS诱导的HIF-1α表达的增加。同时,TIIA(10 mg/kg)也显著地抑制了内毒素性小鼠肺组织中HIF-1α的表达。(5)TIIA预处理对LPS刺激时HIF-1αmRNA的表达没有作用Real-time PCR结果表明,LPS明显增加NR8383与RAW264.7巨噬细胞中HIF-1α的mRNA水平(P < 0.05),但是TIIA预处理(10μg/ml)对LPS导致的HIF-1α的mRNA水平没有明显作用。(6)TIIA预处理抑制LPS刺激时HIF-1α的蛋白翻译Western blotting结果表明,在NR8383与RAW264.7巨噬细胞中,LPS明显活化了AKT与MAPK通路,但是TIIA预处理(0 - 20μg/ml)可以浓度依赖性地逆转上述通路的活化。同时,LPS导致了p70S6K1、S6核糖体蛋白、4E-BP1和eIF4E的磷酸化,但是TIIA预处理(0 - 20μg/ml)可以浓度依赖性的逆转上述蛋白的活化。(7)TIIA预处理通过蛋白酶体途径促进LPS刺激时HIF-1α的蛋白降解Western blotting结果表明,在CHX存在的情况下,在LPS刺激的NR8383与RAW264.7巨噬细胞中,HIF-1α的半衰期分别为8.5分钟与9分钟。TIIA预处理(10μg/ml)后,HIF-1α的半衰期分别降到了4.9分钟与5分钟。TIIA预处理(10μg/ml)明显地抑制LPS刺激时NR8383与RAW264.7巨噬细胞中HIF-1α的表达。但是在蛋白酶体MG132存在的情况下,TIIA的这种抑制作用被取消了。结论:(1)TIIA能抑制内毒素性肺损伤时的炎症反应并能改善小鼠ALI。(2)TIIA改善LPS性肺损伤的作用与其抑制HIF-1α的表达有关。(3)TIIA对LPS诱导的HIF-1αmRNA的表达作用不显著。(4)TIIA通过抑制PI3K/AKT与MAPK通路的活化和相关蛋白翻译调节因子如p70S6K1、S6核糖体蛋白、4E-BP1和eIF4E的磷酸化,降低LPS诱导的HIF-1α的蛋白翻译。(5)TIIA通过蛋白酶体途径促进LPS刺激时HIF-1α的蛋白降解。