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拟穴青蟹（Scyllaparamamosain）,简称青蟹,广泛分布于印度洋和太平洋的热带及温带水域,由于其味道鲜美、营养价值高,已成为我国重要的海洋经济养殖物种。抗菌肽是一类广泛存在于自然界生物体中的小分子多肽,作为生物体先天性免疫防御系统的重要组成部分,在机体对抗外界病原微生物感染和自身免疫调节中发挥重要作用。相较于传统的抗生素而言,抗菌肽不易诱导细菌产生耐药性,具有良好的应用前景。基于本实验室前期建立的青蟹转录组数据库,从病原菌感染诱导显著表达的未知基因中,筛选获得了 2条全长cDNA序列,分别命名为Sparampgin和:Spgillcin。本研究较深入研究了两条基因的表达特性及其产物的抗菌活性,并初步探索了 Spgillcin合成肽段的抗细菌机制,取得以下研究成果:1、克隆获得了拟穴青蟹两条免疫相关的基因Sparampgin和Spgillcin的全长cDNA序列。Sparampgin基因的cDNA全长为 1549 bp（GenBank NO.MZ073367）,其中5’非编码区为132 bp,3’非编码区为811 bp（含polyA）,其开放式阅读框长606 bp,编码201个氨基酸残基,分子量大小为23.026kDa,为阴离子蛋白,含有一段信号肽。Spgillcin基因的cDNA全长为1056 bp（GenBank NO.MZ131629）,5’非编码区为75 bp,3’非编码区为330 bp（含polyA）,开放式阅读框长651 bp,编码216个氨基酸残基,分子量大小为23.615 kDa,为阳离子蛋白,含有一段跨膜结构。2、分析了Sparampgin和Spgillcin基因在正常成熟青蟹组织中的表达分布和胚胎幼体发育时期及蜕皮前后的表达模式。Sparampgin基因在成蟹各组织中广泛分布,在雄蟹鳃中表达量最高;在雌蟹肝胰腺、中肠和鳃中的表达量较高;在幼体发育阶段的蚤状幼体V期表达量较高;在二龄幼蟹蜕皮后,表达量显著高于蜕皮前。Spgillcin基因具有组织分布特异性,在雌雄蟹鳃中显著性高表达;在仔蟹期表达量较高。3、揭示了Sparampgin和Spgillcin基因在外源微生物（或其组分）刺激下的诱导表达模式。在LPS刺激和溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）感染大眼幼体后Sparampgin基因和Spgillcin基因的表达量均发生显著变化。在金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）感染后,Sparampgin基因和Spgillcin 基因分别在鳃和肝胰腺中的表达量显著上调。4、获得了 Sparampgin成熟肽的原核表达产物并分析了其部分生物学功能。通过原核表达系统成功诱导表达Sparampgin成熟肽,并通过亲和层析纯化获得目的蛋白。结果表明rSparampgin能与革兰氏阳性细菌（金黄色葡萄球菌）、革兰氏阴性细菌（铜绿假单胞菌、大肠杆菌）和酵母真菌（白假丝酵母）结合,且还能与微生物的表面组分（LPS、LTA、PGN、Glucan）结合。rSparampgin能显著性降低非小细胞肺癌NCI-H460的细胞活性,诱导细胞凋亡;但不影响中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary cells,CHO）的活性。5、获得了 Sparampgin中具有抗菌活性的短肽Sparampgin88-107。发现Sparampgin88-107具有广谱抗菌活性,对施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri等四种细菌、新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）等四种酵母真菌及黑曲霉（Aspergillus nige）等四种丝状真菌具有良好抗性。Sparampgin88-107对施氏假单胞菌的抗菌活性具有较好的热稳定性,但易受高浓度Na+环境的影响。杀菌动力学曲线显示Sparampgin88-107与施氏假单胞菌共孵6 h后杀菌指数达到100%。此外,Sparampgin88-107对正常拟穴青蟹血淋巴细胞及受测动物细胞（人肝细胞L02、小鼠肝实质细胞AML12、人肝癌细胞HepG2和人非小细胞肺癌细胞NCI-H460）不具有细胞毒性。6、获得了 Spgillcin中具有抗菌活性的短肽Spgillcin177-189。研究发现Spgillcin177-189具有广谱的抗菌活性,对金黄色葡萄球菌（S.aureus）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）等14 种细菌和新型隐球菌（C.neoformans）、黑曲霉（A.nige）等7种真菌具有良好抗性。Spgillcin177-189具有良好的热稳定性,且不易受Na+的影响。杀菌动力学曲线显示Spgillcin177-189与金黄色葡萄球菌（S.aureus）、铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）分别共孵45min、120min、180min时杀菌指数达到100%。Spgillcin177-189能够显著减少金黄色葡萄球菌（S.aureus）和铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）的粘附量以及抑制它们所形成的生物膜。此外,在连续进行26代抗菌试验的过程中,Spgillcin177-189不会诱导金黄色葡萄球菌（S.aureus）和铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）产生显著的耐药性,而左氧氟沙星（Levofloxacin）和头孢他啶（Ceftazidime）均诱导细菌产生不同程度的耐药。结果还表明Spgillcin177-189对正常拟穴青蟹血淋巴细胞及受测动物细胞（人肝细胞L02、小鼠肝实质细胞AML12、人肝癌细胞HepG2和人非小细胞肺癌细胞NCI-H460）无细胞毒性。7、初步阐明了 Spgillcin177-189的抗菌机制结果显示Spgillcin177-189通过作用于细菌细胞膜发挥抗菌作用,使细胞形态发生了明显的变化,如菌体内部起泡,内外膜形态及界限模糊,有部分菌体直接破碎,内容物流出。